ケフィアライフをお勧めする中垣技術士事務所

スカンジナビアの発酵乳ヴィーリからの細胞外多糖は、
マウスの腸内の酪酸とMuribaculumのメンバーを増加させます

Takuya Yamane, Satoshi Handa,Momoko Imai, Naoki Harada, Tatsuji Sakamoto, Testuo Ishida, Takenori Nakagaki, Yoshihisa Nakanoa

Food Chemistry :Molecular Sciences
Available online 22 September 2021, 100042

概要

　ヴィーリのスターターカルチャーには、Lactococcus lactis に属する乳酸菌が含まれています。 これらのバクテリアは大きな多糖類（EPS）を牛乳に分泌し、その結果、ヴィーリの糸引き食感になります。 マウスの実験では大量のEPS（5〜140 mg /日）が腸内細菌叢の調節を通じて人工的に誘発された病気の重症度を軽減することが示されています。 　本研究では、EPSの補足量が正常なマウスの腸内細菌叢に影響を与えるかどうかを調査しました。 グルコサミン含有量の高いEPS（VEPS）は、自家製のヴィーリから分離されました。 通常の食餌を与えられたC57BL / 6J雄マウスは、8μg/ mLのVEPSを含む水道水を自由に飲むことにより、49±1μgのVEPS /日を28日間摂取しました。Muribaculum の相対的な存在量は、VEPSの補給によって大幅に増加しました。 糞便中の酪酸の相対的な存在量は対照マウスで減少し、VEPSはこの減少を防ぎました。 これらの発見は、腸内細菌叢が少量のVEPSによって調節できることを示しました。

1. はじめに

　ヴィーリは、スカンジナビアで生まれた伝統的な発酵乳製品です（Luo＆Deng、2016; Bakry＆Campelo、2018）。 ヴィーリを作るには、ミルクにスターターを接種し、約20ºCで16〜24時間培養します。 ヴィーリスターターには、粘液形成中温性乳酸菌としてLactococcus lactis ssp. cremorisおよび/または Lactococcus lactis ssp. lactis が含まれています（Kahla et al.,2008）。 このスライムはヴィーリにロープ状のテクスチャーを与え、エキソポリサッカライド（EPS）と呼ばれるバクテリアによって細胞外に排泄される多糖類がスライムを作ります。Lacococcus lactisでは、これらのEPSのヴィーリでの生合成（VEPS）は、プラスミドのeps遺伝子クラスターにコードされている酵素によって実行されます（Neve,Geis ＆ Teuber,1988; Zhou,Cui ＆ Qu,2019）。

　最近、乳酸菌によって産生されるEPSの生物活性が集中的に調査され、EPSの健康上の利点が明らかになりました（Saadat,Khosroushahi およびGargari,2019年）。 たとえば、細胞を使用したin vitro実験では、EPS（細胞培養培地で50〜200μg / mL）は、免疫調節（Kitazawa,Yamaguchi,＆Itoh,1992）、抗腫瘍活性（Ishiguro et al., 2017）、抗酸化活性（Ling.,Junhua et al.,2012）、およびα-アミラーゼ阻害活性（Ayyash et al.,2020）を示しており、 インビボ実験では、EPSは免疫調節（Vinderola, Perdigón, Duarte,Farnworth および Matar,2006）および腸のバリア機能の調節（Zhou et al.,2018）を示しました。 これらのマウス実験では、大量のEPS（約100 mg EPS / kg体重/日）が強制経口投与によってマウスに投与されました。 ヨーグルト、ケフィア、ヴィーリなどの発酵乳製品は、安全で人間の健康に有益であると考えられています。 それらの有益な効果は、一部は生きている乳酸菌（プロバイオティクス）によるものであり、一部は細菌によって生成される代謝物によるものです（Kareb.O ＆ Aїder.M,（2019）。 EPSは代謝物の1つであり、ヘテロ多糖含有量は50〜200 mg / Lです（Badel, Bernardi およびMichaud, 2011年）。 報告されたマウス実験でのEPSの摂取量は、成人の場合6g /日に相当します。 機能性食品の観点から人間の健康に対するEPSの有益な効果を見つけ、そのメカニズムを調査するには、実際の用量のEPSを使用したinvivo実験が避けられません。

Kovatcheva-Datchary, ＆Bäckhed, 2016; Morrison＆Preston, 2016; McNabney ＆Henagan, 2017）。 これらの短鎖脂肪酸（SCFA）は結腸細胞に吸収され、これらの細胞のエネルギー源として使用され、循環に輸送されたSCFAはシグナル伝達分子として機能します（Dalile, Oudenhove, Vervliet＆Verbeke, 2019）。 最近、マウス肥満モデル（Lim et al., 2017）および肝障害モデル（Xu et al., 2019）の腸内細菌叢に対するEPSの影響が報告されています。 前者のモデルでは、バクテロイデス科とアッケルマンシア属の相対的な存在量は、EPSグループのマウスで有意に増加しました。 後者のモデルでは、EPSを14日間前投与すると、リポ多糖とD-ガラクトサミンの腹腔内注射後の腸内細菌叢の腸内毒素症が予防されました。 これらの2つの実験では、5〜140 mgのEPS（成人の場合は12〜336 g /日に相当）が強制経口投与によって各マウスに与えられたことに注意する必要があります。

2. 材料と方法

2.1 材料

　ヴィーリスターターは、有限会社中垣技術士事務所（堺、日本）から入手しました。 スターターには、Lactococcus lactis ssp lactis、Lactococcus lactis ssp cremoris、Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis、およびLeuconostoc meseuteroides ssp cremorisが含まれています。 牛乳は地元のスーパーマーケットから購入しました。 2-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩（2-NPH・HCl）、N-（3- ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）、短鎖脂肪酸、および単糖は、東京化学工業（東京、日本）から購入しました。 他のすべての化学薬品（分析グレード）は和光純薬（大阪、日本）から購入しました。

2.2 ヴィーリからのEPSの分離

2.3 動物実験

2.4 VEPSの走査型電子顕微鏡（SEM）

糞便からのDNAの抽出、16S rRNAのV3–V4領域の増幅（センスプライマー、

5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG3 ';

アンチセンスプライマー、

5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTA ATCC-3 '）、シーケンスアダプターによるインデックス作成、およびMiSeq（Illumina, San Diego, CA）を使用したシーケンスは、前述のように実行されました（Harada,Hanada et al.,2020）。 後処理シーケンスデータは、QIIME2パイプラインを使用して分析されました（Bolyen.,Rideout et al.,2019）。 Deblur（Hyde,Gonzalez ＆ Knight.2017）を使用してノイズ除去した後、フィルタリングされたシーケンスデータはSilva（v132）に対して分類されました。 プリンシパル座標分析（PCoA）と階層的クラスター分析は、Rソフトウェアを使用して実行されました。 細菌の16SrRNAシーケンスデータセットは、アクセッション番号DRA012528でDDBJシーケンスリードアーカイブに寄託されています。

　 図2Aは実験計画を示しています。 約50μgのVEPSの1日摂取量は体重増加に影響しませんでした（図2B）。 実験を通して、VEPSグループのマウスは対照マウスと同じ量（3.1〜3.7g /日）の餌を食べました（図2C）。 通常の食餌には4.3％（w / w）の食物繊維が含まれていたため、マウスは1日あたり130〜160mgの食物繊維を摂取しました。 したがって、VEPSの摂取量（50μg/日）は食物繊維の摂取量よりもはるかに少ないです。

　糞便中のSCFAと乳酸を測定しました。予期せぬことに、対照群のマウスでは、酪酸の相対的な存在量が15.0±1.7％から9.5±1.3％に大幅に減少しましたが、VEPS群では、酪酸の相対的な存在量は変化しませんでした（図4C）。他のSCFAと乳酸は、28日後に有意な変化を示さなかった（図3A、3B、3D–G）。 酢酸、プロピオン酸、および酪酸は、腸内で消化されない繊維を代謝する細菌によって生成され、これらの糞便SCFAは、若いマウス（2〜3か月）と比較して高齢マウス（18〜20か月）で減少します（Lee et al 、2020）。
　本研究では、マウスは0日目に2ヶ月齢であり、実験の終わりに3ヶ月齢になりました。
したがって、加齢はおそらく対照マウスの糞便中酪酸の減少の理由ではありません。 低用量のVEPSは、マウスの腸内の酪酸の減少を防ぐようです。