ケフィアライフをお勧めする中垣技術士事務所
| 文献調査（発酵乳、腸内細菌の科学：研究の最前線） |
プロバイオティクス発酵アロニアメラノカルパベリージュースを配合した ヨーグルト風製品の物理化学的、抗酸化的、微生物的、官能的特性の評価 |
Stavros Plessas , Ioanna Mantzourani , Antonia Terpou , and Argyro Bekatorou |
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| 要約 |
本研究の目的は、凍結乾燥添加物、すなわち (i) プロバイオティクス Lactobacillus plantarum ATCC 14917 培養物、および (ii) L. plantarum ATCC 14917発酵ブラックチョークベリージュース、および市販のスターター培養物で強化されたヨーグルトのさまざまな配合を作成することでした。目標は、製品の機能性を高め、栄養価を最適化することでした。その後、これらの新しいヨーグルトスタイルの配合を市販のヨーグルトと比較しました。すべての製品は好ましい物理化学的特性を示し、プロバイオティクス株は、保存期間全体を通じて一貫して 7 log cfu/g を超える生存レベルを維持しました。添加物を含まない L. plantarum 細胞で生成された発酵乳、および提案された乳酸菌発酵チョークベリージュースで生成されたヨーグルトは、最高の乳酸生成を示しました (保存終了時までに 1.44 g/100 g ヨーグルト)。凍結乾燥発酵チョークベリージュースで製造したヨーグルトでは、離水レベルが低いことが観察されました。乳酸菌発酵凍結乾燥チョークベリージュースで調製したヨーグルトは、総フェノール含有量と抗酸化能の上昇を示しました (それぞれ 25.74 µg GAE/g および 69.05 µmol TE/100 g)。さらに、官能検査では、発酵ジュースを組み込んだサンプルに独特のフルーティーな風味があることが明らかになりました。結果は、プロバイオティクス L. plantarum 発酵チョークベリージュースがヨーグルトの抗酸化能と有益な細菌の生存率の両方を高める一方で、特に凍結乾燥製剤の形で容易に適用および商品化できることを実証しています。 |
| 目次(クリックして記事にアクセスできます） |
| 1. はじめに |
| 2. 材料と方法 |
| 2.1.微生物スターター培養物 |
| 2.2. ブラックチョークベリージュースの製造と発酵 |
| 2.3. 新しいヨーグルト風製品の製造 |
| 2.4. 物理化学分析 |
| 2.5. 微生物学的評価およびプロバイオティクス生細胞数 |
| 2.6. 抗酸化能 |
| 2.7. 官能特性 |
| 2.8. 統計分析 |
| 3. 結果と考察 |
| 3.1. 配合された強化物質が製品の物理化学的特性に与える影響 |
| 3.2. 抗酸化活性とフェノール含有量 |
| 3.3. ヨーグルト風製品の冷蔵保存中の微生物安定性 |
| 3.4. L. plantarum の生存率と可能性のある有益な効果 |
| 3.5. 官能評価 |
| 4. 結論 |
本文 |
| 1.はじめに |
| 今日、健康と健康的な習慣の促進は消費者にとって大きな関心事であり、機能性食品はますます認知され、人気が高まり、受け入れられています [1,2]。特に、発酵食品とその有益な微生物叢は、今後数年間で機能性食品産業の成長を牽引すると予想されています [3]。多様な発酵食品の中で、プロバイオティクス食品は機能性食品産業における重要なカテゴリーとして浮上しています [4,5,6]。プロバイオティクスは生きた微生物で構成されており、十分な量（> 106 cfu/mL）を摂取すると、宿主に健康上の利点をもたらします [4]。プロバイオティクスの潜在的な健康効果は多数のパラメータに依存しますが、重要な特徴は、摂取中に十分な数の生細胞を保持することです。さらに、プロバイオティクス株が消化管を通過して腸に定着し、有益な健康効果をもたらすことが重要であると考えられています [4,5]。別の観点から見ると、食品発酵のために接種されたプロバイオティクス細胞は、食品基質に応じて幅広い細菌代謝産物を生成することができます [3,7]。特に、プロバイオティクス発酵食品は、食事性ポストバイオティクスの重要な供給源になる可能性があります。ポストバイオティクスとは、国際プロバイオティクスおよびプレバイオティクス科学協会 (ISAPP) によって定義された新しい用語で、宿主に健康上の利益をもたらす無生物 [死んだ] 微生物および/またはその成分の調製物です [8]。 |
| 発酵は微生物の活動と増殖を制御するバイオプロセスであり、牛乳などの食品の保存によく使用されます。ヨーグルトは一般的に発酵される乳製品で、さまざまな栄養素やミネラルが豊富で、その栄養価と消化のしやすさから世界中で消費量が増加しています [9]。特に、ヨーグルトの年平均成長率は6.9%で増加しており、世界の市場価値は2024年までに510億米ドルに達すると予想されています [10]。したがって、イノベーションは、持続可能な開発を維持しながら消費者の需要に適応するための乳製品業界の最も重要な課題の1つです。同様に、発酵飲料は特定の官能特性と健康上の利点をもたらすユニークな生理活性化合物を提供するため、現代の食品業界で広く製造されています [11,12,13,14,15,16]。 |
| スターターカルチャーは発酵食品や飲料の製造において重要な役割を果たし、栄養価、機能性、風味、保存性の向上に貢献しています。現代の微生物学の進歩により、特定のスターターカルチャーを特定して応用することで、食品に望ましい特性を持たせることが可能になりました [17]。食品発酵におけるスターターカルチャーの主な応用形態は凍結乾燥（フリーズドライ）形態であり、食品配合物に直接組み込むことができます [18]。この直接固まる乾燥培養形態は、プラント内での継代培養が不要になり、バルク培養の準備にかかるコストが削減され、バクテリオファージ感染から保護されるため、産業上の観点から非常に人気があります [4]。例えば、プロバイオティクス株の Lactobacillus plantarum は、生理活性化合物のレベルを高めることで食品の有益な価値を高めることができる株として認識されています [19,20]。この能力は発酵食品の栄養、官能、保存期間の特性にプラスの影響を与える[4,11]。 |
| ヨーグルトは伝統的に、スターターカルチャーとして細菌株 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus および Streptococcus thermophilus 株を用いて牛乳を発酵させることによって生産され、プロバイオティクス移行の主要な乳製品の 1 つです [9]。一般に、ヨーグルトはさまざまな生理活性化合物で強化することができ、免疫システムの強化、アレルギー症状の緩和、抗酸化特性の提供、心血管疾患の回避、エネルギーレベルの増加、認知機能の促進など、健康をサポートおよび強化するための幅広い可能性を提供します [1,21]。新鮮な果物やドライフルーツ、フルーツジュースなどの天然生理活性添加物は、その高い栄養価と生理活性含有量でよく知られています。これらは人間の栄養に不可欠な成分を提供し、その摂取は多くの健康上の利点に関連しています [11]。最近の傾向では、ヨーグルトの安全性と栄養価を高めるために、プロバイオティクスと天然生理活性添加物を組み合わせています [22]。ヨーグルトに生理活性や機能特性を改善するために添加される特定の成分の例としては、オイゲノールやシナマルデヒドナノエマルジョンなどの天然植物抽出物[23]、β-カロチン/大豆タンパク質分離物を含む脂質微粒子[24]、緑茶[25]、生理活性ペプチド、γ-アミノ酪酸[26]、シーバックソーンベリー[22]や黒桑の実[27]などの果物が挙げられます。 |
| 果汁とプロバイオティクス菌やポストバイオティクスなどの生理活性物質との有益な相乗効果、およびそれらの乳製品への組み込みは、機能性食品の進歩の新しい時代を開く可能性を秘めています。たとえば、食品発酵のスターター培養物または補助培養物として添加されたプロバイオティクス細胞は、製品の栄養価を高めるフェノール化合物と短鎖脂肪酸を生成することが報告されています [28]。また、果物と果汁がプロバイオティクスの成長に及ぼす影響は、種と株に特異的であることが報告されています [11,12,15,22]。たとえば、小麦ふすまに固定化されたラクトバチルス・パラカゼイによるザクロジュースの発酵により、高品質で潜在的にシンバイオティクスの飲料が生産されました。このプロセスにより、総フェノール含有量（TPC）と芳香揮発性プロファイルが増加しました [12]。さらに、L. plantarum および L. acidophilus のプロバイオティクス株は、生存能力と果汁を細胞合成の基質として利用する能力を示しており、プロバイオティクス強化果汁生産に有望であることが示されています [13]。別の研究では、L. plantarum および L. acidophilus によるイチゴジュースの発酵により、得られた飲料の色、フェノール、抗酸化特性が改善されました [14]。さらに、L. plantarum によるナツメ-クコの実ジュースの発酵により、抗酸化活性が高まりました [16]。最後に、ケフィア粒から分離された新しい潜在的プロバイオティクス株である L. paracasei は、チョークベリージュースの発酵を評価したところ、発酵中および保存中に高い細胞生存率を示しました。発酵ジュースは、非発酵ジュースと比較して香りの複雑さを維持し、総フェノール含有量および抗酸化能が増加しました [15]。 |
| 凍結乾燥発酵ジュースを機能性成分のキャリアとして利用するという概念は比較的最近のものであり、ヨーグルトのスターターカルチャーやヨーグルトの栄養価への影響についてさらに調査する余地が十分にあります。最近の研究では、凍結乾燥桑の果汁 [29]、凍結乾燥マキ（Aristotelia chilensis）およびムラ（Rubus ulmifolius）の超音波抽出物の粉末 [30]、凍結乾燥大豆および緑豆の皮の粉末 [31] などを組み込むことで、発酵中および保存中のヨーグルトの官能特性が改善され、機能性が強化されることが実証されています。しかし、プロバイオティクス発酵アロニアメラノカルパ（ブラックチョークベリー）ジュースを強化したヨーグルトの物理化学的、抗酸化的、微生物的、官能的特性に関する評価の報告は不足しています。ブラックチョークベリーはアロニアベリーとしても知られ、その高いポリフェノール含有量と優れた抗酸化能により、多様な健康効果があることが知られています[15]。さらに、アロニアベリーには抗酸化作用、抗炎症作用、抗菌作用などの健康促進特性とプレバイオティクス効果を示すアントシアニンが豊富に含まれていることも注目に値します[32]。 |
| 前述の研究を踏まえ、本研究の主な焦点は、プロバイオティクス菌株 L. plantarum ATCC 14917 と、同じ菌株を使用した発酵チョークベリージュースを、さまざまなヨーグルト配合の開発のための凍結乾燥添加物として使用できる可能性を評価することでした。得られたヨーグルトの品質は、物理化学的特性 (酸度、総フェノール含有量、抗酸化活性)、官能特性、および保管中の微生物学的安定性など、いくつかのパラメータに基づいて評価されました。 |
| 2. 材料と方法 |
| 2.1. 微生物スターター培養物 |
| S. thermophilus と L. delbrueckii ssp. bulgaricus を 2:1 の割合で混合した市販のレディバット細菌培養物 (Lyofast Y 436 A、Sacco Systems、Cadorago、 Italy) をヨーグルト製造用のスターター培養物として使用しました [33]。スターター培養物は、製造元の指示に従って、滅菌スキムミルク 10 mL で 43 °C で 1 時間培養して活性化しました。プロバイオティクス菌株 L. plantarum ATCC 14917 は凍結乾燥形態 (LGC Standards、Middlesex, UK) で活性化され、製造元の指示に従って、de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) 液体培地 (Merck Darmstadt、Germany) で 37 °C で 24 時間攪拌 (180 ± 5 rpm、大気約 5% CO2) された三角フラスコで培養されました。すべての培地は、使用前に 121 °C で 15 分間 (1～1.5 atm) オートクレーブ滅菌されました。得られた湿潤細胞塊を遠心分離（5000rpmで10分間、Sigma 3K12遠心分離システム、Bioblock Scientific、 Illkirch Cedex, France）により回収し、その後、細胞生存率の低下を最小限に抑えるために5℃/分の冷却速度で-44℃まで凍結した[12]。次に、回収した細胞塊を凍結保護なしで48時間凍結乾燥させた（FreeZone 4.5凍結乾燥システム、Labconco、Kansas City, MO, USA）。 |
| 2.2. ブラックチョークベリージュースの製造と発酵 |
| ブラックチョークベリー（Aronia melanocarpa）は、ギリシャのトラキア州エヴロス島の北東部に位置するネア・オレスティアーダの地元の有機農業生産者から新鮮な状態で調達されました。 |
| ブラックチョークベリーは慎重に選別され、滅菌した1/4リンゲル液で徹底的に洗浄された。その後、ベリーは一般的な家庭用ミキサーで10分間ブレンドして粉砕され均質化された[34]。果肉は滅菌布ストレーナーで取り除かれ、遠心分離機にかけられた（3000 rpm、10分）。アロニアメラノカルパジュースの主な化学組成は、以前の研究で決定されたとおり、次のとおりであった：リンゴ酸4.71 g/L±0.05、ソルビトール20.0 g/L±0.2、グルコース11.05 g/L±0.2、フルクトース9.13 g/L±0.3 [15]。ジュースを抽出した後、滅菌した脱イオン水を加えて初期の糖濃度（約 40 g/L）を調整し、ジュースを低温殺菌（80 °C、10 分）しました [35]。ブラックチョークベリージュースを室温まで冷却した後、100 mL のジュースあたり 1 g（乾燥重量）の凍結乾燥した L. plantarum を懸濁しました。発酵開始時の L. plantarum 株の生存率は、選択培地カウント [36] により 8.3 log cfu/mL と評価されました。その後、ジュースは 30 °C で 48 時間発酵され、同時にさまざまな時間間隔で Na2CO3 溶液を追加することで pH を 4.0 ± 0.2 に維持しました。その後、各発酵ジュースを凍結乾燥しました [12]。 |
| 2.3. 新しいヨーグルト風製品の製造 |
| ヨーグルト風製品は、ギリシャ産の低温殺菌均質化牛乳（pH 6.8 ± 0.1、脂肪3.7%、総固形分13.0%）を発酵培地として製造した。牛乳は最初に90℃で5分間加熱し、40℃で冷却し、その後、滅菌ガラス容器に100mLずつ5等分した[33]。5つの異なる配合を製造した。すなわち、ヨーグルトスターターカルチャー（5%接種物、S. thermophilusおよびL. bulgaricus）を接種したCY（対照サンプルとして使用した市販のヨーグルト）、ヨーグルトスターターカルチャーとL. plantarum（5%接種物、1:1）を接種したLPCY、L. plantarumのみを接種したLPY（5%接種物）。 PDCY にはヨーグルトスターターカルチャーと L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースを接種し (接種率 5%)、PDY には L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースを接種しました (接種率 5%)。サンプルは培養 (40 ± 1 °C、約 5～5.5 時間) され、pH が 4.6 ± 0.1 に低下するまで酸性化が監視されました (Consort D130 システム、Turnhout, Belgium)。pH が低下したら、発酵させた各サンプルを 4 °C で 28 日間冷蔵保存しました。 |
| 2.4. 物理化学分析 |
| 冷蔵保存 1 日後、各発酵乳サンプルの組成分析と pH 測定を実施した。具体的には、サンプルの総固形分 (方法 990.19)、灰分 (方法 945.46)、脂肪 (方法 989.05) を AOAC (2005) の方法を使用して分析した（訳者注：AOAC は、メリーランド州ロックビルに本部を置く501の非営利科学団体です。 1884年に公式農業化学者協会として設立され、1991年にAOACインターナショナルになりました。化学分析および微生物分析の結果の信頼性を高めるように設計された標準化された化学分析方法を公開しています）。脂肪とタンパク質の含有量は、それぞれソックスレー法とケルダール法で測定した。サンプルの pH 値は、デジタル pH メーター (Hanna HI99161) を使用して電極を直接浸漬して測定した。 |
| 糖および有機酸の定量には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用した。簡単に説明すると、ラクトースは、SCR-101Nステンレススチールカラム、LC-9Aポンプ、CTO-10Aオーブン（60℃）、およびRID-6Aインデックス検出器を備えたHPLCシステム（Shimadzu, Kyoto, Japan）で測定した。乳酸は、Shim-pack IC-A1ステンレススチールカラム、LC-10Aポンプ、CTO-10Aオーブン（40℃）、およびCDD-6A検出器を備えたHPLCシステム（Shimadzu, Kyoto, Japan）で測定した。定量分析のために、糖および酸の標準溶液（Saint Louis, Misouri, USA, Sigma-Aldrich Ltd.）を超純水（Milli-Q, Darmstadt, Germany, Merk）で様々な濃度に調製した[33]。 |
| 冷蔵保存中のヨーグルト風製品に対するサプリメントの潜在的影響を分析するため、製造初日に離水率 (S%) を評価しました。10 g のサンプルを 15 mL ファルコン チューブに入れ、遠心分離 (350× g、20 分、4 °C) し、分離したホエーを計量しました。離水率は次の式で計算しました。 |
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| 2.5. 微生物学的評価およびプロバイオティクス生細胞数 |
| 微生物学的分析は、文献に若干の修正を加えて [22]、冷蔵保存 (4 °C) の 28 日間、さまざまな時間間隔で実施しました。具体的には、ヨーグルト風製品 10 g を 90 mL の滅菌リンゲル液 (LABM、Heywood、ベリー、英国) で完全に均質化し、滅菌 0.1% (wt/vol) ペプトン水 (Oxoid Ltd、ハンプシャー、英国) で段階希釈しました。各サンプルの微生物負荷は、選択培地に播種して測定しました。具体的には、S. thermophilus を 1% ラクトースを含む M17 寒天に播種し、好気的に培養しました (40 °C、72 時間)。 L. bulgaricus は、10% ソルビトールを含む de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) 寒天培地に塗布し、嫌気的培養 (37 °C、48 時間) を行った。酵母およびカビは Potato Dextrose Agar 培地に塗布し、好気的培養 (30 °C、72 時間) を行った。大腸菌は Violet Red Bile 寒天培地に塗布し、嫌気的培養 (30 °C、24 時間) を行った。ブドウ球菌は Baird Parker 寒天培地に塗布し、好気的培養 (37 °C、24 時間) を行った。その後、ペトリ皿をさらに 24 時間放置し、S. aureus 株 (黒色または灰色のコロニー) [37] の生存率を製造元の指示 (LABM、英国) に従って評価した。 |
| L. plantarumの生菌数は、L. bulgaricus [38]に対する増殖を促進する10 mg/Lのバンコマイシン抗生物質を含むMRS寒天培地に塗布し、好気的に（37℃、48時間）培養することによって測定した。 |
| 上記の培地はすべて使用前に滅菌（121℃、15分）した。細胞数はlog cfu/gとして表した[33]。 |
| 2.6. 抗酸化能 |
| フリーラジカル消去活性は、フリーラジカルDPPH（2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル）法[39]を使用して測定しました。DPPHラジカル消去活性は、次の式に従って測定しました（Ac：対照溶液の吸光度、As：試験溶液の吸光度）。 |
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| 総フェノール含有量は文献[40]に従ってFolin-Ciocalteu法で測定した。濃度は没食子酸当量（GAE）で表した。 |
| 2.7. 官能特性 |
| ヨーグルト風サンプル（LPCY、LPY、PDCY、PDY）はすべて、乳製品の消費に慣れた10人の成人（研究室メンバー、事前のトレーニングを受けた）による官能評価を受け、市販のスターターカルチャー[33]を使用して作られたヨーグルトと比較されました。評価の前日に作られた約50gのサンプルが評価者に提供されました。評価者は、25歳から45歳の非喫煙者の男性と女性の両方で、評価プロセスに参加しました。サンプルは50mLの透明プラスチックカップで提供され、それぞれに3桁のコードがランダムに付けられました。官能評価セッションは個別のブースで行われました。試食のたびに、口の中をすっきりさせるためにパンとミネラル含有量の少ない水が提供されました。審査員は、香り、フルーツの風味、白の色の濃さ、食感、ボディの硬さ、酸味、全体的な風味、全体的な許容度という主なカテゴリーに属する特性について、0～10 段階 (0 = 許容できない、10 = 優れている) でスコアを付ける指示を受けました。評価尺度の最後に、審査員は追加のコメントを提供するよう求められました。 |
| 2.8. 統計分析 |
| すべての発酵実験は 3 回繰り返して実施しました。結果は一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して分析しました。異なる処理は同じ保管期間で比較され、同じ処理からのサンプルは同じ期間に比較されました。有意差 (係数、ANOVA 表、および有意性) を決定するために、Duncan の多重範囲検定が適用されました。すべての分析で、p 値 < 0.05 が統計的に有意であると判断されました。 |
| 3. 結果と考察 |
| 3.1. 配合された強化物質が製品の物理化学的特性に与える影響 |
| 28 日間冷蔵 (4 °C) 中の発酵乳サンプルの pH、乳酸、ラクトース含有量に関する結果を表 1 に示します。全体的に、保存中のすべてのサンプルで pH 値の低下が認められました。乳酸乳発酵中の pH の低下は、ラクトースが乳酸に分解されることに起因し、乳酸の生成量が多いほど pH 値が低くなります [33,41]。プロバイオティクス菌株を含むサンプルの pH 値は、対照サンプル (CY) と比較して大幅に低いレベルで検出されました。さらに、すべての発酵乳サンプル (LPCY、LPY、PDCY、PDY) にプロバイオティクス菌株を配合すると、乳酸生成が増加し、対照 (CY) と比較して発酵後および冷蔵中の pH 値が低下しました。この結果は、プロバイオティクス培養物を添加するヨーグルト製造では市販のヨーグルトに比べて乳酸生成量が増加し、pH値が低下することを示した以前の研究と一致しており、これはプロバイオティクス株の蓄積強化によるものである [33,42,43]。乳酸菌による牛乳発酵では、牛乳ラクトースから主に乳酸（0.6～1%）とその他の代謝産物が生成される。したがって、後酸性化の結果として、保管初期のpH低下が予想される。PDCYおよびPDYサンプルでは、pH低下を伴うラクトースの最も顕著な減少が認められた。したがって、pH低下の傾向は、乳酸生成の増加と、おそらくギ酸、アセトアルデヒド、酢酸などの他の有機化合物の増加の結果である [33,43,44]。 |
| 表1 4℃で28日間冷蔵保存した発酵乳サンプル中のpH、ラクトース、乳酸の平均値と標準偏差 |
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結果は平均 (n = 3) ± 標準偏差として表されます。 CY: 市販のスターターカルチャーを使用したヨーグルト。 LPCY: 市販のヨーグルトスターターカルチャーと L. plantarum を使用した発酵乳。 LPY: L. plantarum で発酵させた牛乳。 PDCY: 市販のヨーグルトスターターカルチャーと L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースを使用した発酵乳。 PDY: 発酵させたチョークベリージュースを使用した発酵乳。 行内の異なる上付き文字は、各スターターカルチャーの同時分析における統計的に有意差を示します (Tukey の HSD 多重範囲検定による MF-ANOVA)。 |
| 保存中にすべてのサンプルで pH が低下したのは、おそらく有機酸の生成によるもので、低温でも活性を維持すると思われる乳酸菌の活性によるものです。特に、補助プロバイオティクス培養物を含むサンプルは pH 値が低く、乾燥サプリメントを含むサンプルはさらに低い pH レベルを示し、乳酸生成が最も高くなりました。具体的には、保存期間の終了時には、サンプル PDY が最低 pH (4.24) を記録し、次に PDCY サンプル (pH 4.27) が続き、その他のサンプルの pH は 4.48～4.35 の範囲でした。L. plantarum を加えた発酵チョークベリージュースを加えて製造した発酵乳サンプルで観察された明確な酸性化は、チョークベリーに含まれるフェノール化合物が乳酸菌の代謝活性を刺激する効果によるものと考えられます。ただし、これらのサンプルの pH は許容範囲内にとどまっていたことに留意する必要があります。この結果は、フェノール化合物が乳酸発酵に良い影響を与えることを確認した最近の研究と一致していまする[14,45]。 |
| 製造初日のタンパク質、脂肪、全固形分、灰分含有量は表2に示されており、それぞれ3.3～3.6（％）、3.5～3.6（％）、16.6～16.9（％）、0.5～0.7（％）の範囲でした。すべてのサンプルで脂肪含有量がわずかに減少したのは、微生物の脂肪分解活性によるものと考えられます[46,47]。タンパク質含有量はサンプル間でばらつきが見られました。具体的には、コントロールサンプル（CY）は、LPCYおよびLDY（3.5％）と同等のタンパク質含有量を示しましたが、PDYサンプルはわずかに低いタンパク質含有量（3.3％）を示しました。対照的に、PDCYサンプルはサンプルの中で最も低いタンパク質含有量を示し、3.0％でした。 |
| 表 2 発酵乳サンプルの物理化学的性質 (製造初日) |
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結果は平均 (n = 3) ± 標準偏差として表されます。 TPC: 総フェノール含有量。 CY: 市販のスターターカルチャーを使用したヨーグルト。 LPCY: 市販のスターターカルチャーと L. plantarum を使用したヨーグルト。 LPY: L. plantarum で発酵させた牛乳。 PDCY: 市販のヨーグルトスターターカルチャーと L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースで発酵させた牛乳。 PDY: L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースで発酵させた牛乳。 列内の異なる上付き文字は、各スターターカルチャーの同じ分析パラメータで統計的に有意な差があることを示します (Tukey の HSD 多重範囲検定による MF-ANOVA)。 |
| ヨーグルトやヨーグルト風製品におけるホエーの分離は、外観や物理的特性に影響を与える重要な要素です [48]。ヨーグルトや酸乳の離水は、製品の表面でのホエーの分離を意味し、ヨーグルトの容器を開けたとき、または密封された容器内で発生する可能性があります。この分離は、主に (i) カゼインに比べてホエータンパク質の濃度が高いこと、(ii) 総固形分の濃度が低いこと、および (iii) 保存中に生乳酸菌によって生成される有機酸の変化に起因します [49]。本研究の結果によると、離水は初期のスターター培養と酸性化方法、および添加された粉末サプリメントによって影響を受けました (表 2)。L. plantarum で発酵させたチョークベリージュース (PDCY、PDY) を添加すると、総固形分含有量が増加し、市販のヨーグルトサンプルと比較して発酵乳の一貫性が向上します。さらに、以前の研究で示されているように、抗酸化作用の高い果物やサプリメントを添加すると、ホエーの分離を減らし、発酵乳製品の保存安定性を高める可能性があります[27,50]。 |
| 3.2. 抗酸化活性とフェノール含有量 |
| 最近の研究 [11,51,52] で示されているように、乳酸菌を発酵に利用した場合、乳酸発酵はフレッシュジュースの抗酸化能、フェノール含有量、風味を大幅に高めることが知られています。同様に、この研究の結果は、市販のスターターカルチャーまたは発酵乳 (PDY、PDCY) と組み合わせた粉末サプリメントの添加により、抗酸化活性のレベル (約 69 µmol TE/100 g) が上昇したことを示しています。一般に、補助プロバイオティクス L. paracasei 株で発酵させたすべてのサンプルは、プレーンヨーグルト (DPPH ラジカル消去活性が 49 µmol TE/100 g に達した) とは対照的に、より高い抗酸化能を示しました。結果は、プロバイオティクス菌株が発酵乳製品の抗酸化能力を高め、一方でチョークベリー成分も抗酸化化合物の直接的な寄与、または乳酸菌活性から得られる生物変換によって抗酸化物質含有量を大幅に高めることができることを示しました。 |
| L. plantarumで発酵させたチョークベリージュース（PDY、PDCY）で製造したサンプルでは、他のすべてのサンプルと比較して総フェノール含有量も向上しているように見えました。文献によると、チョークベリーに含まれる生理活性ポリフェノール（フェノール酸、フラボノール、アントシアニン、プロアントシアニジン）の寄与源に関して、総抗酸化活性は主に遊離ポリフェノールの寄与に依存します[53,54]。結果として、チョークベリーをサプリメントとして取り入れることは、ポリフェノールの天然源を提供することで機能性食品の開発に貢献できることは明らかです。 |
| 3.3. ヨーグルト風製品の冷蔵保存中の微生物安定性 |
| 微生物安定性は、保存中の食品、特に乳製品の物理化学的および官能的特性、ならびに安全性の維持に極めて重要です [55]。発酵乳サンプル中の腐敗の可能性のある微生物数 (log cfu/g) を、冷蔵保存中 28 日間にわたって監視しました。前述のように、プロバイオティクス菌株を添加したサンプルでは、冷蔵保存 28 日間中に腐敗やブドウ球菌、大腸菌群、腸内細菌、酵母、カビなどの病原性微生物は検出されませんでした (表 3)。一方、市販のヨーグルトサンプルでは、保存 21 日目以降に酵母とカビが検出されました。この結果は、市販のヨーグルトの pH 値がわずかに高いことと、他のすべてのサンプル (LPCY、LPY、PDCY、PDY) で観察された L. plantarum の拮抗作用によるものと考えられます。 |
| 表3 28日間冷蔵保存（4℃）中のサンプルの微生物数 |
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結果は、平均値（n = 3）±標準偏差として表されます。 nd：検出されず。 CY：市販のスターターカルチャーを加えたヨーグルト。 LPCY：市販のヨーグルトスターターカルチャーとL. plantarumを加えた発酵乳。 LPY：L. plantarumで発酵させた牛乳。 PDCY：市販のヨーグルトスターターカルチャーとL. plantarumで発酵させたチョークベリージュースを加えた発酵乳。 PDY：L. plantarumで発酵させたチョークベリージュースを加えた発酵乳。 列内の異なる上付き文字は、各スターターカルチャーの比較について、分析の同時時点での統計的に有意な差を示しています（TukeyのHSD多重範囲検定によるMF-ANOVA）。 |
| S. thermophilus、L. bulgaricus（表3）、およびL. plantarum（図1）の微生物数もモニタリングしました。冷蔵中の乳酸菌数は、栄養要因と環境要因に複雑に関連しています[4]。表3に示すように、L. plantarumで発酵させたチョークベリージュースを配合すると、冷蔵中のPDCYサンプル中の乳酸菌数が上昇し、市販のヨーグルトサンプルとは対照的でした。より具体的には、これによりS. thermophilusとL. bulgaricusの数が増加し、保存28日目に8 log cfu/mLを超えましたが、対照ヨーグルトは7 log cfu/mLで有意に低い生存率を示しました。この結果は、補助として発酵させたチョークベリージュースによって提供される栄養素とプレバイオティクスオリゴ糖の強化に起因する可能性があります[22,56,57]。この結果は、プレバイオティクス成分が乳製品および腸内微小環境における乳酸菌の生存率を高めることができることを示唆する以前の研究と一致している[4,33,44,58]。さらに、S. thermophilusおよびL. bulgaricusの生細胞数は、市販のヨーグルトサンプルと比較して、サンプルLPCYで有意に低い濃度で検出された（表3）。これは、牛乳発酵中にプロバイオティクスL. plantarum培養物が他の細菌に対して拮抗する効果に起因する可能性があります[33,41]。さらに、S. thermophilusおよびL. bulgaricusは好熱性細菌（最適温度40〜45℃）に属するため、低温の影響がそれらの生存率に影響を与える可能性があります。 |
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図 1 L. plantarum の生細胞数 (log cfu/g)。 LPCY: 市販のスターター培養物と L. plantarum を加えたヨーグルト、 LPY: L. plantarum で発酵させた牛乳、 PDCY: 市販のヨーグルトスターター培養物と L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースを加えた発酵牛乳、 PDY: 発酵させたチョークベリージュースで発酵させた牛乳。 バー内の異なる上付き文字は、各スターター培養物の比較分析の同時時点での統計的に有意な差を示しています (Tukey の HSD 多重範囲検定による MF-ANOVA)。 |
| 比較的高濃度のフェノール化合物は細菌の増殖を阻害できることが報告されている [59]。この研究では、これらのサンプルは発酵したチョークベリージュース由来のフェノール化合物が豊富に含まれていたにもかかわらず、保存初日から最終日までPDCYサンプルでS. thermophilusとL. bulgaricusの両方の生菌数が多くなっていました。一方、市販のスターターカルチャー（CYとLPCY）で製造されたサンプルは、PDCYサンプルと比較して製造初日以降、生存率が著しく低かった。これはPDCYサンプルのフェノール含有量が高いことに起因している可能性があり、以前の研究と一致して、牛乳発酵中にS. thermophilusとLactobacillus spp.の増殖を促進する可能性がある[25]。 |
| 3.4. L. plantarum の生存率と可能性のある有益な効果 |
| 図 1 は、冷蔵 (4 °C) 中のサンプル LPCY、LPY、PDCY、PDY におけるプロバイオティクス菌株 L. plantarum の個体数を、さまざまな時間間隔 (1、3、7、10、14、18、21、28 日目) で示したものです。健康に寄与する生理活性化合物を生成できる、新しくて従来とは異なるプロバイオティクス源から、十分に裏付けられた独自の健康上の利点が生まれる可能性があり、そのため、保存中も菌株の生存率を維持することが重要です [4,60]。L. plantarum の初期生存率は、ジュース発酵 (48 時間) 後に 8.8 log cfu/mL と記録され、発酵ジュースの凍結乾燥後に生存率がわずかに低下 (8.6 log cfu/mL) したことに留意することが重要です。この結果は、凍結保護剤を使用せずに発酵ジュースを凍結乾燥するという厳しい条件にさらしたことに起因する可能性があります。発酵乳サンプル中のプロバイオティクス菌株の生存率に関しては、すべてのサンプルにおいて、L. plantarum 菌株が保存期間を通じて一貫して 8 log cfu/g を超えるレベルを維持していたことに注目することが重要です。 |
| ヨーグルト風製品はすべて、消費時の生存プロバイオティクス細胞数の推奨レベルと一致し、プロバイオティクスとみなされる基準を満たしています [4]。この結果は注目に値します。以前の研究では、L. plantarum 株は他のプロバイオティクス株ほど牛乳発酵に適していないことが示唆されており、ゲノムおよび牛乳発酵テストでこの特定の株の乳酸生成レベルが低いことが確認されているためです [19]。逆に、チョークベリージュースの発酵に非常に適していることが実証されており、チョークベリーと一緒に牛乳に添加すると非常に効果的であることが証明されています。上記の観察に関連して、L. plantarum をスターター培養物として使用して製造されたサンプル (LPY) と、L. plantarum と市販のヨーグルト培養物の両方を使用して製造されたサンプル (LPCY) では、L. plantarum で発酵させたチョークベリージュースを使用して製造されたサンプル (PDCY) と比較して、保管期間終了時にプロバイオティクス細胞数の有意な減少 (p < 0.05) が観察されました。この細胞数の減少は、発酵乳サンプルの酸性環境に起因する可能性があり、これが遊離細菌細胞の生存に悪影響を及ぼし、それらの減少につながります[33]。さらに、この減少は、以前の研究で確認されているように、LacZ / LacLM遺伝子の欠損に起因する可能性があります[19]。この欠損により、特に冷蔵中にL. plantarumがラクトースを発酵できなくなり、生存率が低下します。対照的に、チョークベリージュースとL. plantarum（PDCY）で製造されたサンプル、およびチョークベリージュースとL. plantarum（PDY）で発酵させた牛乳は、保存期間全体（4°C、28日間）を通じて生存プロバイオティクス細胞数に顕著な安定性を示しました。この結果は、粉末サプリメントで生成されたサンプルのフェノール含有量の増加に起因する可能性があり、チョークベリーに含まれるアントシアニンはプレバイオティクス活性により乳酸菌の増殖を促進する可能性がある[57,61]。 |
| 最近の文献では、プレバイオティクスが乳製品の製造および保管中の酸性および過酷な環境条件からプロバイオティクス細胞を保護することにも寄与することが示唆されている [5]。同様に、本研究では、シンバイオティクスサプリメントを提供する乾燥したチョークベリージュースに含まれるプレバイオティクス成分によって、L. plantarum の生存率が向上する可能性がある [62]。重要なことに、以前の研究では、フェノール化合物とプロバイオティクス細菌との相乗的な相互作用が提案されており、その結果、抗酸化能力が向上し、消化管内でプロバイオティクス細胞が定着することが示唆されている [63]。これらの相乗的な相互作用は、細菌のライフサイクル中に細菌によって生成される小さな代謝産物を含むポストバイオティクス効果とも関連している可能性がある。これらの代謝産物は、細菌の増殖と細胞間コミュニケーションの調節に重要な役割を果たしている。さらに、それらは有益な細菌の増殖に寄与し、さまざまなストレスに対する保護を提供する [64]。 |
| これらの知見に基づき、本研究では、ヨーグルト風製品の製造のための粉末サプリメントとして、プロバイオティクス細菌とフェノール化合物で知られるチョークベリージュースのブレンドを提案している。チョークベリージュースの成分を取り入れたこの戦略は、結果として得られる乳製品中のプロバイオティクスの持続的な高生存率に貢献すると考えられている。さらに、これまでの研究では、食品業界におけるL. plantarum株の多様な機能特性が強調されている。これらの特性には、栄養価、風味特性、抗酸化および抗菌活性の向上、食品の保存期間の延長などがあり、望ましくない化合物も減らす[65]。しかし、乳製品にアレルギーや不耐性のある人々にとっては、乳酸菌分離株によるフルーツジュースの発酵が代替手段となる可能性があることを強調しておくことが重要である。チョークベリージュースなどのプロバイオティクス強化フルーツジュースは、以前の研究で実証されているように、プロバイオティクスを補給する機能的で健康的な飲料として研究することができます[13,15]。 |
| 3.5. 官能評価 |
| 全体的に、すべてのサンプルは高い合格スコアを獲得し、不快な風味は検出されず、全体的に好印象でした (図 2)。L. plantarum を含む発酵チョークベリージュースで調製したサンプルは、その並外れた香りとフルーツ風味が際立っていました。この特徴は、植物由来の食品の重要な成分として認識されているフェノール化合物の豊富さに起因する可能性があります。フェノール化合物は、風味、渋み、色など、食品の重要な官能特性に関連しています [66]。図 2 に示す結果によると、発酵乳サンプルの色は、PDY および PDCY サンプルに発酵チョークベリージュースを追加することで大幅に影響を受けました。サンプル PDCY (図 2) および PDY (図 2) のフェノール化合物の豊富さ (表 2) は、最初のジュース含有量によって提供され、発酵乳の風味に貢献し、その独特の芳香特性を際立たせます。同様に、プロバイオティクスやヨーグルト培養物の代謝過程を通じて生成される揮発性フェノールは、風味と芳香プロファイルを豊かにすることに寄与する可能性があり、これは先行研究の結果と一致している[66]。 |
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図 2 サンプルの官能特性のレーダープロット。 CY: 市販のスターター カルチャーを使用したヨーグルト。 LPCY: 市販のヨーグルト カルチャーと L. plantarum で発酵させた牛乳。 LPY: L. plantarum で発酵させた牛乳。 PDCY: 市販のヨーグルト カルチャーと L. plantarum で発酵させたチョークベリー ジュースで発酵させた牛乳。 PDY: 発酵させたチョークベリー ジュースで発酵させた牛乳。 |
| すべてのサンプルの食感は高い評価スコアを獲得しましたが、これはおそらく離水値が許容範囲内にとどまっていたためです。これは 乳酸菌代謝物の存在に起因する可能性があり、製品の食感の硬さを高める可能性があります。たとえば、プロバイオティクスと 乳酸菌株は菌体外多糖類を生成することで知られており、発酵乳の食感に寄与し、離水を減らし、製品の全体的な口当たりとボディを改善します [67]。同様に、ヨーグルトの食感は菌体外多糖類の生成によって向上することが示されています。菌体外多糖類は製品内の水と相互作用し、ゲル状構造の Guzel-Seydim、Sezgin、Seydim を作り出します [67]。本研究のサンプルで観察された食感スコアの上昇は、全固形分などの他の成分に起因する可能性もあります。特筆すべきは、PDCYとPDY（L. plantarumを加えた発酵チョークベリージュース入りヨーグルト）の食感スコアが他のサンプルに比べてわずかに高いのは、発酵ジュースパウダー由来の炭水化物と繊維に関連している可能性があるということである。これらの成分は、ヨーグルトの食感を改善する上で重要な役割を果たす可能性がある。このような品質特性は、発酵乳製品の粘度と硬さに大きな影響を与える可能性があるため、食品業界にとって非常に重要である。さらに重要なのは、今日の状況では、消費者が新しいフレーバーの組み合わせ、特に健康に有益な効果をもたらす成分を組み合わせたものを試すことにますます積極的になっていることである。この変化は、特にCOVID-19パンデミックの余波で、健康の重要性が高まっていることによって強調されている[68]。 |
| 4. 結論 |
| 凍結乾燥発酵チョークベリージュースとプロバイオティクス菌株 L. plantarum ATCC 14917 を効果的に組み合わせて、機能性発酵乳製品の製造に使用しました。この革新的なヨーグルト風製品は、4 週間の保存期間を通じて、強力なプロバイオティクス培養菌の生存率と強化されたフェノールプロファイルを維持しました。特に、L. plantarum を組み込んだすべてのケースで、達成された生存率は、特定のプロバイオティクス食品の健康効果をもたらすために必要な閾値 (106～107 cfu/mL) を一貫して上回りました。さらに、組み込んだ発酵チョークベリージュースを含む新しいヨーグルト風製品は、保存期間全体を通じて微生物学的安全性を示しました。凍結乾燥発酵チョークベリージュースに代表されるこの新しいサプリメントは、プロバイオティクス製品としての需要を満たすだけでなく、元のジュースの生理活性フェノール成分と 乳酸菌代謝によって生成された成分を融合します。すぐに利用できる機能性サプリメントは、特にパンデミック後の時代には、食品業界にとって非常に魅力的です。したがって、この研究で開発された画期的な機能性ヨーグルト風製品は、抗酸化物質、プレバイオティクス、プロバイオティクス、ポストバイオティクスの有益な特性を組み合わせ、乳製品業界での商品化に大きな可能性を示しています。最後に、今後の研究努力は、新製品における乳酸菌遺伝子の発現によってもたらされる栄養面と相互作用をさらに深く掘り下げることに焦点を当てるべきです。これは、最終製品で発生する代謝化合物を完全に理解し、これらの製品の摂取に関連する潜在的な健康効果と利点を明らかにするために不可欠です。 |
参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
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この文献は、Foods. 2024 Jan; 13(1): 111.に掲載されたAssessment of the Physicochemical, Antioxidant, Microbial, and Sensory Attributes of Yogurt-Style Products Enriched with Probiotic-Fermented Aronia melanocarpa Berry Juice.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |
