ケフィアライフをお勧めする中垣技術士事務所
| 文献調査（発酵乳、腸内細菌の科学：研究の最前線） |
牛乳加工および乳製品からの心臓保護ペプチド： |
Armin Mirzapour-Kouhdasht and Marco Garcia-Vaquero |
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概要 |
| 最近の研究により、乳製品に由来するペプチドが、世界中の主な死因の1つである心血管障害を予防する可能性があることが明らかになりました。このレビューでは、乳製品由来ペプチドの生物学的活性に対する経口摂取後の胃腸消化プロセスの有益または有害な影響と、さまざまな乳製品処理方法（発酵および酵素加水分解）および乳製品（ヨーグルト、チーズ、ケフィア）に由来する生物活性ペプチドの主な心臓保護効果（in vitro、in vivo、およびex vivo※で測定）の概要を説明します。分子ドッキングや定量的構造活性相関など、乳製品の生物活性ペプチドの構造と機能の関係、およびそれらのアレルギー誘発性と毒性について入手できる主な文献も、これらの化合物の商業化を管理する主な法的枠組みとともに取り上げられます。生物活性ペプチドの供給源として製品を商品化している現在の製品と企業も要約され、機能性食品および栄養補助食品の市場における乳製品の生物活性ペプチドの産業的利用の主な課題と機会が強調されます。 ※）訳者注：ex vivoは「生体の外で」という意味のラテン語で、臓器や組織を生体の外に取り出してきて、「臓器単体」を対象とする研究です。 |
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| 目次(クリックして記事にアクセスできます） |
| 1.はじめに | 2.ミルク由来の生理活性ペプチド |
| 3.ヨーグルトからの生物活性ペプチド |
| 4.チーズからの生物活性ペプチド |
| 5.ケフィアからの生物活性ペプチド |
| 6.In vivoおよびex vivo研究 |
| 7.生物活性ペプチドの構造と機能の関係 |
| 8.生物活性ペプチドに対する消化管消化の影響 |
| 9.生物活性ペプチドのアレルギー誘発性と毒性 |
| 10.生物活性ペプチドの法規制要件 |
| 11. 将来の展望と結論 |
1.はじめに |
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生理活性ペプチドは、強力な健康促進特性を持つアミノ酸の短鎖（2〜20残基）として説明できます[1,2,3]。 一般に、加工乳（加水分解または発酵）および乳製品（チーズ、ヨーグルトおよびケフィア）は、生物活性ペプチドの優れた供給源と見なすことができます。 これらのペプチドは、乳タンパク質の無傷の構造内では不活性であり、さまざまな加水分解法によって放出されると、強力な生物学的活性を獲得します[4]、 乳製品の加工中にタンパク質分解スターターを使用してミルクをin vitroで発酵させたり、胃腸（GI）消化の過程でタンパク質を摂取した後にin vivoで発酵させたりします[5,6]。 したがって、生物活性ペプチドの生産は、年間生産量が約1億8000万〜1億9千万トンのホエイプロテインなどの副産物であるため、生理活性ペプチドは乳業の拡大事業と見なすことができます[7]。 |
| 生理活性ペプチドは非常に強力な健康増進特性を示しており、心血管障害（CVD）などの多くの疾患のリスクを低下させることができます[1,2,3]。 心血管障害は、心不全、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、末梢血管疾患、およびその他の心臓異常を含む複数の障害を含む世界的な用語であり[8]、毎年世界中の一般人口で最も一般的な死因と見なされています[9 ]。 高血圧（hypertension）や高い血圧を下げることは、心血管障害を防ぐための重要な目標です。 血圧を下げるには2つの異なるメカニズムがあります。レニン-アンジオテンシン系（RAS）に続いて、酵素レニンはアンジオテンシノーゲンからアンジオテンシンIへの変換を触媒します。カスケード反応に続いて、アンジオテンシン変換酵素（ACE）はアンジオテンシンアンジオテンシンIをアンジオテンシンIIは、最終的に高血圧を発生させる血管収縮剤です。 さらに、アンジオテンシン変換酵素は、血管拡張剤であるブラジキニンを不活性成分に変換するキニン-一酸化窒素システム（KNOS）で役割を果たします[10]。 生物活性ペプチドを含む生物活性化合物によるレニンとアンジオテンシン変換酵素の両方の阻害は、心血管障害を制御するための有望な標的戦略として使用できます。したがって、乳製品および派生生物活性ペプチドは、図1に要約されているように、これらの心臓保護活性を発揮する複数の標的を持つ生物活性ペプチドの供給源として、これらの障害の予防に優れた候補となります[11、12、13]。 |
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| 図1 乳製品に由来する生物活性ペプチドの心臓保護効果の潜在的なメカニズム |
| 今日まで、乳製品と生物活性ペプチドに関するいくつかのレビューは、生物活性ペプチドを生成および分析する方法[14,15,16]またはこれらのペプチドの消費に関連する複数の健康上の利点[15,17]に特に焦点を当ててきました。 化合物の作用機序や、これらの化合物を食品として投与した場合の生物学的特性に対する胃腸消化の影響についての詳細な説明はありません。 現在の作業は、ミルク加工（酵素的および微生物的加水分解）および乳製品（ミルク、ヨーグルト、チーズおよびケフィア）から発見された、in vitro、in vivo、およびex vivoでの抗高血圧活性、ならびにそれらの構造に対する胃腸消化の影響などを最先端の生物活性ペプチドをレビューすることを目的としています。 さらに、これらの生物活性ペプチドの構造と機能の関係、およびそれらのアレルギー誘発性と毒性を評価する研究も報告されます。 生物活性ペプチドの供給源として現在市場に出ている製品、およびこれらの化合物の商業化を規制する世界中で利用可能な法的枠組みも要約され、乳業によるこれらのペプチドの将来の使用および利用のための明確なシナリオを確立することを目的としています。 |
2.ミルク由来の生理活性ペプチド |
| ミルクからの生物活性ペプチドは通常、in vivoおよび/またはin vitro消化プロセスによって生成された2〜50アミノ酸の配列であり[18]、カゼインからの放出時に心臓保護効果を示します[4]。 これらのペプチドは、図1で前述したように、いくつかの経路を通じて心血管障害のリスクを低下させるのに寄与する可能性があります。 心血管障害予防のためのこれらの経路には以下が含まれます：（i）腎臓から分泌されるレニンを阻害する。 （ii）アンジオテンシンIからアンジオテンシンIIへの変換を阻害する。 （iii）ブラジキニンの不活性成分（非血管拡張剤）への変換を阻害する[10,19]。 |
| 世界中の牛乳生産量は過去10年間成長を続けており、2015年には4億9,700万メートルトンの牛乳が生産され、2021年までに最大5億4,400万メートルトンのレベルにまで上昇しました[20]。 心臓保護ペプチドの生成に使用できるミルクの主なタンパク質性成分には、カゼイン（αS1-カゼイン、αS2-カゼイン、β-カゼイン、およびk-カゼイン）、α-ラクトアルブミン（α-LA）、β-ラクトグロブリン（ β-LG）、免疫グロブリン、ラクトフェリン、プロテアーゼ-ペプチド画分、血清カゼイン、およびトランスフェリンがあります[21]。 これらのタンパク質は、in vivoまたはin vitro消化のいずれかに使用して生物活性ペプチドを生成し、さまざまな分離技術で精製して心臓保護効果を評価することができます。 |
| タンパク質源、ペプチド配列、タンパク質分解活性など、さまざまな要因がミルクからの生物活性ペプチドの心臓保護効果に影響を与えます。 タンパク質分解酵素によるミルクの加水分解プロセスは、現在、乳タンパク質から心臓保護生物活性ペプチドを得るための好ましいアプローチです。 この方法の利点には、高い再現性、ターゲットの特異性、および加水分解中の制御可能な条件が含まれ[22]、工業レベルでのこれらの化合物の生成に本当に適した費用効果の高いプロセスが得られます。 加水分解プロセス後の乳タンパク質に由来する生理活性ペプチドの心臓保護効果を研究しているいくつかの研究があります[23、24、25、26、27]。 加水分解条件は、生物活性ペプチドの生産効率と心臓保護活性に影響を与える可能性があります。 酵素加水分解プロセスの4つの主要な要素が導入され、加水分解温度、時間、pH、酵素と基質の比率など、乳製品に由来する生成された生物活性ペプチドの心臓保護効果を制御しています。 Guo et al [28]が行った研究では、ホエータンパク質濃縮物加水分解物（Lactobacillus helveticus LB13からの粗プロテイナーゼによって得られた）のアンジオテンシン変換酵素阻害剤の最適な加水分解条件が応答曲面法（RSM）によって決定されました。 この研究の結果は、92.2％のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を達成するための最適条件は、0.60、8時間、pH 9.18、および38.9℃の温度の酵素対基質比であることを示しました。加水分解の程度は、生物活性ペプチドの心臓保護活性に正に関連する要因です[29]。 この加水分解の程度は、通常、処理時間、温度、およびpHを、各タンパク質に固有の特定のレベルまで増加させることによって増加します。このレベルでは、好ましくない条件下での加水分解酵素の変性のために、それ以上の加水分解の程度は認められません[30]。 酵素と基質の比率は、ペプチドの加水分解の程度と心臓保護効果に直線的に関連していません[31]。 この効果は、タンパク質と酵素の触媒部位との接触を可能にしない酵素的立体効果、および基質拡散と飽和反応速度の低下に起因する可能性があります[30]。 Mazorra-Manzano et al [32]が実施した研究では、ホエイプロテインを加水分解して、植物プロテアーゼを使用してアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを生成しました。 ホエイプロテイン加水分解物（特にβ-ラクトグロブリン由来のもの）は、75〜90％の最高のアンジオテンシン変換酵素阻害を示しました。 しかし、著者らは、その効果の原因となるこれらの加水分解物からの生物活性ペプチドのアミノ酸配列を決定しませんでした。 |
| タンパク質分解酵素を使用してさまざまな乳タンパク質から発見されたペプチド配列、および科学文献で報告されている心臓保護活性を表1にまとめています。 Lin et al [33]は、ヤクミルクからのキュラカゼインを使用し、さまざまな酵素（アルカラーゼ、α-キモトリプシン、サーモリシン、プロテイナーゼK、トリプシン、およびパパイン）を使用して加水分解しました。 著者らは、in vitroでアンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つ3つの生物活性ペプチド、PFPGPIPN、KYIPIQ、およびLPLPLLを特定し、IC50はそれぞれ12.79、7.28、および10.46μMでした[33]。 Lin et al [34]は、2つのアプローチ（サーモリシン+アルカラーゼとサーモリシン+プロテイナーゼKの組み合わせ）によって加水分解されたキュラカゼインがアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの供給源である可能性があることを示しました。 同定された生物活性ペプチド（KFPQY、MPFPKYP、MFPPQおよびQWQVL）は化学的に合成され、その中でペプチドKFPQYのIC50が12.37μMである最高のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を示しました。 |
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| 発酵プロセスからの生物活性ペプチドの生成は、潜在的な心臓保護効果を有するペプチドを得るための卓越したアプローチである可能性があります。 これらの生物活性ペプチドは、乳酸菌（LAB）などの一般に安全と認められているさまざまな（GRAS）微生物を使用して乳製品発酵から放出される可能性があります。 乳タンパク質は、スターター、一般的には乳酸菌からのタンパク質分解酵素の優れた窒素源であり、乳製品の加工中に心臓保護ペプチドを生成します[44、45、46]。 さまざまな微生物培養を使用した乳発酵プロセスに由来する心臓保護生物活性ペプチドの包括的なリストを表2に示します。 |
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| Li et al [47]は、Lactobacillus plantarumとBifidobacterium animalis ssp. lactisをStreptococcus thermophilesと組み合わせて、発酵乳から生物活性ペプチドを生成し、これらのペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性をin vitroで及ぼす影響を調査しました。 著者らは、Lactobacillus plantarumおよび／またはBifidobacterium animalisと組み合わせたStreptococcus thermophilesが、Streptococcus thermophiles単独と比較して生物活性ペプチドの産生およびアンジオテンシン変換酵素阻害活性を増加させることを決定しました。 |
| ラクダの乳は、伝統医学における生物学的利益のために伝統的に消費されてきましたが、これらの健康上の利益のための作用機序の知識は、今日まで十分に調査されていません。 ラクダの乳の発酵中に、さまざまな研究者が生物活性ペプチドの放出を報告しました。 最近の研究では、Solanki and Hati [63]によって示されているように、Lactobacillus rhamnosus MTCC5945によるラクダ乳の発酵中に放出されたペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性が示されています。 これらの著者は、9つのペプチド、MQTDIMIFTIGPA、VRTPVTVQTKVDNIKKY、EQAGRQRQGG、VRTPVTVQTKVDNIKKY、AXEAIFGAVVXIDL、VIAGGCAAIIG、GLVASIPR、QCDIMIFTIGPA、およびVNPNTPIRを特定しました。これらはすべて、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性を示します[63]。 |
| ウシ、ラクダ、ヤギなどのさまざまな動物源から得られたミルクの発酵に由来する生物活性ペプチドの心臓保護効果の違いを調査することは価値があります。 ただし、現在、この側面に関する情報や科学的報告はありません。 このトピックの包括的な知識を得るには、さらなる研究が必要です。 In silico手順(訳者注：in silico（イン・シリコ）は、in vivo （生体内で）や in vitro （ガラス、すなわち試験管内で）などに準じて作られた用語で、文字どおりには「シリコン内で」の意味であり、実際には「コンピュータを用いて」を意味する)は、研究者が既知の配列決定された乳タンパク質から放出されるペプチドを予測する予備的な発見を達成するのに役立つ可能性があります。 ある研究では、母乳に似た完璧な食料源である山羊乳を、ペプシンとキモトリプシンAで加水分解して、ACE阻害活性を持ついくつかの生理活性ペプチドを得ることにより、インシリコで分析しました。 α-S1、α-S2、およびβカゼイン画分から可変長のいくつかのペプチド（ジペプチドからウンデカペプチド）が同定されました[64]。 |
| 3.ヨーグルトからの生物活性ペプチド |
| 乳酸菌によるヨーグルト製造中のミルク発酵は、図2に要約されているように、心臓保護活性を持つ生物活性ペプチドを取得するための費用効果が高く実用的な手順として研究されています[65,66]。 この図に示されているように、スターターカルチャーを追加する前に、生乳に追加のタンパク質（つまり、ホエイプロテインコンセントレート）とタンパク質分解酵素を組み込むと、心臓保護ペプチドの生成が向上します。 |
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| 図2 ヨーグルト製造プロセス中の心臓保護ペプチドの生成 |
| ヨーグルトの定期的な摂取は、高血圧（17％）および心血管障害（21％）のリスクの低下に関連しています[67]、 これは、酵素加水分解または発酵プロセス中、ならびに生成物の消化管消化中に生成される生物活性ペプチドの含有量に直接関連しています[68,69,70]。 |
| ヨーグルトから発見された多くのアンジオテンシン変換酵素阻害性生物活性ペプチド、およびエンドセリン－1放出の阻害、ブラジキニンの血管拡張活性の増強[72]、内皮からの一酸化窒素生成の改善[49]、および血管拡張活性を刺激するためのオピオイド受容体への結合[66,73]を含む他のメカニズムを通じて降圧活性を発揮することができる他のペプチドがあります[71]、 |
| 発酵乳製品から心臓保護ペプチドを発見するために行われた大量の研究[44,45,46,47,62,63,74]の中で、ヨーグルトからこれらのペプチドを報告した研究はほんのわずかです[66,75,76,77]。 乳酸菌を使用した乳発酵は、タンパク質、特にカゼインから心臓保護生物活性ペプチドを生成するための優れた手順と見なすことができます[74]。 VPPとIPPは、ヨーグルトで生成される2つの主要な生理活性ペプチドであり、アンジオテンシン変換酵素阻害のメカニズムはカプトプリルやリシノプリルなどの合成薬と同様であると報告されています[77]。 タンパク質含有量を増やし、ヨーグルトでタンパク質分解菌株を使用すると、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つペプチドαS1-カゼインf（24–32）およびβ-カゼインf（193–209）が放出されました[75]。 Papadimitriou et al [76]は、2種類の伝統的なギリシャの羊ヨーグルトを準備し、製品の物理化学的および心臓保護特性を分析しました。 1つのヨーグルトはLactobacillus delbrueckiisubspbulgaricusϒ10.13とStreptococcus thermophilusϒ10.7の通常の培養物を使用して作られ、もう1つのヨーグルトタイプにはLactobacillus paracasei subsp. paracaseiDC412が含まれていました。 著者らは、β-カゼイン114-121に由来する、高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性（IC50 0.37 mg / mL）を持つペプチドYPVEPFTEを特定しました。このペプチドは、γ-カゼインからも同定されました[78]。 このペプチドのさらなる研究により、その心臓保護作用機序がアンジオテンシン変換酵素の阻害およびブラジキニン分解酵素の遮断に関連していることが明らかになりました[72]。 さまざまなスターターカルチャーによって生成されたヨーグルトにおける生物活性ペプチドの心臓保護効果と作用機序、および最終製品を濃縮する無数の生物活性ペプチドにつながる可能性のある微生物タンパク質分解システムの違いを明らかにするには、追加の研究が必要です。 |
| 4.チーズからの生物活性ペプチド |
| 生理活性ペプチドは、さまざまな種類のチーズの主要な成分です。 質量分析法とバイオインフォマティクスベースの手順を組み合わせた手法を使用した高度なペプチドミクスアプローチの適用により、チーズ製造プロセス中に数千の生物活性ペプチドが生成される可能性があることが実証されました[79,80]。 生理活性ペプチドは、チーズの風味と食感に寄与するだけでなく、心臓保護、免疫調節、抗菌および抗酸化特性などのさまざまな健康促進作用も明らかにします[81,82,83,84]。 |
| 文献に記載されているすべての心臓保護ペプチドの中で、ペプチドIPPおよびVPPは36種類のチーズで同定されています。 VPP濃度は0〜224 mg /kgチーズの範囲でしたが、IPP含有量は0〜95.4 mg/kgチーズの範囲でした。 両方の濃度が最も高く（VPPおよびIPPでそれぞれ224.1および95.4 mg / kg）、アンジオテンシン変換酵素阻害活性も最も高い（IC50 2.6 mg / mL）ハードチーズ「ベルナーオーバーラント産のHobelkäse」で同定されました[85 ]。 |
| これらの生物活性ペプチドの含有量で認められる違いは、生乳の前処理、適用される微生物培養、および加熱殺菌および熟成条件を含む処理条件に関連しています。 したがって、栄養補助食品の市場に参入する可能性のあるこれらの生物活性ペプチドを高濃度で一定濃度で含むチーズを製造するための再現可能なプロセスを生成することを強くお勧めします[86]。 |
| 複数の種類のチーズに含まれる生理活性ペプチドを説明および特定するいくつかの研究を表3にまとめています。 文献で報告されているこれらすべてのデータから、チーズの種類、使用する微生物培養、元のタンパク質源など、チーズ製造プロセス中の心臓保護ペプチドの生成に影響を与えるいくつかの要因があると結論付けることができます。 さらに熟成プロセスは、ペプチドの生成と最終製品の健康増進効果にも強く影響します[12]。 熟成はチーズ製造の重要なステップであり、特に酵素凝固プロセスに関連し、最終製品の風味と食感の特性を向上させます。 タンパク質分解、脂肪分解、解糖、遊離脂肪酸異化作用[87]を含むいくつかの生化学反応は、チーズの品質に影響を与える可能性があり、タンパク質分解は生物活性ペプチドの生成に最も関連があります。 熟成中のタンパク質分解プロセスに関与する主な薬剤には、残留凝固剤からの酵素、ミルクからのプラスミン、一次および二次培養または細菌汚染物質から分泌される微生物酵素、ならびに熟成プロセスをスピードアップするために付加されるプロテアーゼが含まれます[87,88]。 残留凝固剤とプラスミンがカゼインを加水分解して大中型ペプチドを形成するため、生物活性ペプチドの生成は主にチーズ熟成の初期段階で発生する可能性があります。 その後、他のタンパク質分解剤が分解して、心臓保護効果のある小さな生物活性ペプチドとアミノ酸残基を生成します[18,88]。 |
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| Atanasova et al [95]は、同じ微生物培養を使用して生成されたブルガリアのヤギ、ヒツジ、およびウシの白い塩漬けチーズにおける心臓保護ペプチドと遊離アミノ酸の存在を研究しました。 アンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つ主な生理活性ペプチドは、αS1（RPKHPIKHQ.G、RPKHPIKHOGLPQEVLN.E、K.HPIKHQ.G、V.APFPEVF.G、L.KKYKVPQL.E、およびY.KVPQL.E）とβ-CN（Q.DKIHPF.A）から同定されました。 著者らはまた、αS2から心臓保護ペプチドは同定されなかったと述べた。 別の研究では、潜在的な心臓保護効果を持つ100以上の生物活性ペプチドが、 in silicoおよびin vitroアプローチを使用してゴーダチーズから同定されました[96]。 著者が示したように、同定された生物活性ペプチドは、αS1、αS2、β、およびκを含むさまざまなカゼイン配列で暗号化されました。 |
| 全体として、さまざまな加工手順で得られたさまざまな種類のチーズに由来する生物活性ペプチドを心臓保護剤として使用できます。これらのチーズ品種に固有の複数の細菌培養を使用して、さまざまな種類のチーズに生物活性ペプチドが存在するかどうかを評価する研究は限られています。 さらに、これらの化合物の一貫した存在、ならびにインビボでのそれらの利用可能性および有効性を評価するために必要な研究がまだあります。 |
| 5.ケフィアからの生物活性ペプチド |
| ケフィアは、コーカサス山脈でのミルク発酵から製造された酸味とわずかにアルコール性の風味を備えた、生産と消費の長い歴史を持つ飲料です。 この製品は、ケフィア粒の混合ミクロフローラによるミルク発酵の結果であり、発酵ミルクとは組成と官能特性が異なります[97,98,99]。 証拠は、ケフィアの心臓保護効果が、この製品の発酵プロセス中に生成される生物活性ペプチドの存在に関連していることを示しています。 Şanlietal[100]が実施した研究では、補助微生物培養がケフィアのアンジオテンシン変換酵素阻害およびペプチドプロファイルに及ぼす影響を調べました。 この研究により、Lactobacillus helveticusで発酵させたケフィアを長期間保存すると、強力なアンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つ製品が得られることが明らかになりました。 これらの発見は、Lactobacillus helveticusでケフィアを発酵させている複数の著者によって確認されました[101,102]。 Shu et al [103]は、ヤギ乳ケフィアがカゼイン上のケフィア粒のミクロフローラのタンパク質分解活性により心臓保護効果を持ち、降圧特性を持つ生物活性ペプチドを生成することを示しました。 さらに、著者らは、これらのペプチドの生成が製品の保管中に継続し、生物活性ペプチドの構造、したがってケフィアのアンジオテンシン変換酵素阻害率に変化をもたらすことも確認しました。 Amorim et al [104]は、製品のトリプシン消化とショットガンプロテオミクスを実行することにより、ケフィアの心臓保護作用メカニズムを研究しました。 著者らは、新薬や栄養補助食品の生成に役立つ可能性のあるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つ35の生物活性ペプチドを特定しました。 |
| 全体として、ケフィアで同定された生物活性ペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性は、発酵プロセス中に使用される条件（つまり、pH、温度、時間）および製品の保管条件によって影響を受ける可能性があります。 したがって、最高のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を達成するために、製品の処理および保管条件を最適化するために、さらなる作業が必要です。 |
| 6. In vivoおよびex vivo研究 |
| In vivo測定は通常、ラットモデルにおける収縮期血圧の記録を指します[105,106]。 これらの手順は、動物に標準的な食餌を12時間与え、さまざまな濃度の生理活性ペプチドの溶液を経口投与することに基づいています[105,106]。 動物の収縮期血圧は、非侵襲的方法、すなわちテールカフによって測定され、研究者は生物活性ペプチドとカプトプリルまたは他の降圧薬の効果を比較することができます[105]。 アンジオテンシンIはそれ自体に血管作用の影響を及ぼさないため、ex vivo研究は、動脈壁のアンジオテンシン変換酵素によるアンジオテンシンIからのアンジオテンシンIIの生成を監視する孤立した動脈で行われます[107]。 |
| これらのin vivoおよびex vivo手順を使用して、乳製品からいくつかの生物活性ペプチドが同定されています（表4）。 小山ほか [108]は、ミルク由来のペプチド（KFWGK）の経口投与が、5μg/ kgの最小有効量で自然発症高血圧ラット（SHR）に強力で長期的な降圧作用を示したことを報告しました。 ケフィアから心臓保護ペプチドを同定するために、in vivo研究も実施されました[104]。 この研究では、2腎臓ワンクリップ（2K1C）手順、プレチスモグラフィー、および血液サンプル中アンジオテンシン変換酵素活性の評価を含む、3つのin vivo手順が実施されました。 著者らは、強制経口投与によるケフィアによる治療により、収縮期動脈圧が37 mmHg低下し、アンジオテンシン変換酵素活性の19％が抑制されたと報告しました。 |
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| *自然発症高血圧ラット。 **ウサギの頸動脈セグメント。 ***表示されていません。 |
| 体内の降圧ペプチドのメカニズムを知ることは非常に重要です。 Gleeson、Brayden、およびRyan [107]は、ex vivoおよびin vivoモデルを使用して、イソロイシン-プロリン-プロリンおよびロイシン-リジン-プロリンの配列を持つ2つの心臓保護ペプチドの腸透過性を測定しました。 著者らは、前述のペプチドがPepT1を介した取り込みまたは小腸の傍細胞経路のいずれかを介して浸透できることを示しました。 |
| Xue、Wang、Hu、Wu、Wang、Wang、およびYangによって実施された研究[115]で、著者らは、ペプシンとトリプシンによって加水分解された牛乳カゼインから、非常に安定した（複数のpHおよび温度）心臓保護ペプチド、すなわちYQKを生成および同定しました。 In vivo実験は、SHRに経口投与された場合のこのペプチドの降圧効果を明らかにし、治療された動物の収縮期血圧を有意に低下させた。 別の研究では、20人の男性SHRを使用して、ウシラクトフェリン加水分解物に由来する3つのペプチド（LIWKL、RPYL、およびLNNSRAP）の心臓保護効果を分析しました[116]。 この研究の結果は、研究された3つのペプチドがin vivoで血圧を下げるときに効果的であり、ペプチドLNNSRAPが最も高い降圧活性を持つことを示しました。 著者らはまた、6匹のオスのニュージーランド白ウサギを使用してex vivo分析を行い、その結果、ペプチドRPYLおよびLIWKLが対照サンプルと比較してアンジオテンシン変換酵素を有意に阻害することが明らかになりました。 場合によっては、生物活性ペプチドで達成されたin vitroおよびin vivo実験からの矛盾する結果が観察される可能性があります。たとえば、Geerlings et al [117]が報告したように、ヤギ乳からのTGPIPN、SLPQ、およびSQPKの配列を持つ生物活性ペプチドは、カプトプリルと比較してin vitroIC50が高かったが、in vivo研究では同様の活性が示された。 このような場合やより深刻な紛争の場合、有効で再現性のあるデータに基づいて決定を下せるように、in vitro、in vivo、ex vivo、およびin silicoの研究を含むすべての利用可能な情報を説明するより包括的で統合された研究を開発する必要があります。 |
| 7.生物活性ペプチドの構造と機能の関係 |
| 強化された心臓保護特性のための生物活性ペプチドの化学構造は、今日まで完全には解明されていない。 しかし、いくつかの研究では、ペプチドの心臓保護効果の主なメカニズムの1つであるアンジオテンシン変換酵素阻害活性に影響を与えるペプチドの構造的特徴が確認されています。[118,119]。 |
| アミノ酸配列と特定の金属の存在は、生物活性ペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性に大きな影響を与える可能性があります。 生物活性ペプチドの3つのC末端位置のそれぞれに疎水性アミノ酸が存在し、C末端に塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、およびヒスチジン）が存在すると、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が大幅に増加する可能性があります[118,119]。 C末端にプロリンが存在すると、ペプチドの-COO基をアンジオテンシン変換酵素活性部位との相互作用に適したコンフォメーションに固定することができます[81,120]。 研究により、最後から2番目の位置にプロリンが存在するとアンジオテンシン変換酵素活性部位への結合が増強されることが明らかになっています[81,121]。 これらの構造的特徴は、マンチェゴチーズに由来するペプチドDKIHPおよびDKIHPFで確認されました[122]。 |
| さらに、アンジオテンシン変換酵素活性部位でのZn2 +イオンの存在も、ペプチドの心臓保護効果の重要な要因です[123]。 これを説明するために、アンジオテンシン変換酵素は亜鉛プロテアーゼのカテゴリーに属していることは注目に値します。これは、基質と反応するための補因子としてこのイオンが必要であることを意味します。 アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、Zn2 +を取り巻く歪んだ形状を形成する可能性があり、ペプチド-ACE複合体の維持を助け、より強力な酵素阻害をもたらします[124]。 心臓保護ペプチドの構造と機能の関係、およびアンジオテンシン変換酵素酵素との相互作用を明らかにするために、いくつかの分子ドッキング技術を適用して、これらの相互作用を研究することができます（図3を参照）。 過去数十年の間に、特に2013年のノーベル化学賞が授与されて以来、分子モデリングの革新の改善は大きな進歩を示してきました[125]。 すべての分子モデリング手順の中で、分子ドッキングは最も広く適用されている方法です[126]。 |
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| 図3 ペプチド（LL）とアンジオテンシン変換酵素の相互作用の一般的な概要 |
（a）アンジオテンシン変換酵素構造と活性部位でのその最良のドッキングポーズ（灰色) （c）触媒部位でのアンジオテンシン変換酵素－ペプチド相互作用ビュー（相互作用の中心にある亜鉛イオンを参照）、 （d）活性部位でのペプチドの最良のドッキングポーズ、 （e）ドッキング前のアンジオテンシン変換酵素残基との四面体配位亜鉛イオン、 （f）ドッキング後のアンジオテンシン変換酵素活性部位でのペプチドと亜鉛イオン間の相互作用。 アンジオテンシン変換酵素の疎水性残基と親水性残基は、それぞれ青と黄色で表されます。 活性部位の他の残基は灰色で、亜鉛原子は紫色です。 緑の破線と灰色の太線は、それぞれ水素結合と亜鉛配位結合を表しています。 エルゼビア2011の許可を得て、パン、郭、趙、曹操[123]から複製。 |
| 心臓保護効果を有する新規の生物活性ペプチドを生成するためのプロセスは、化合物の同定前の単離および精製のいくつかのステップを含み、これは労力および費用がかかり、また様々な活性ベースの精製ステップ中にこれらの化合物のいくつかを失うことにつながる可能性がある。 定量的構造活性相関（QSAR）は、潜在的な心臓保護効果を持つ新しい生物活性ペプチドを発見するために使用される新しい戦略です[127,128]。 さらに、乳製品の生物活性ペプチドの構造と機能の関係に関する情報を収集することにより、研究者はより強力な心臓保護剤を設計することができます。 定量的構造活性相関は、部分最小二乗法などの統計的重回帰分析を使用して、化学構造とその生物活性の関係を解明および確立するためのケモメトリックスに基づくモデリングツールです。 したがって、生物活性データは、生物活性ペプチドの構造の関数としてモデル化することができます[129,130]。 いくつかの研究では、乳製品の生理活性ペプチドの定量的構造活性相関阻害活性[33,34,131,132,133,134,135,136,137,138,139]およびレニン阻害活性[140]について定量的構造活性相関を調査しました。 私たちの知る限りでは、レニン阻害性の生物活性ペプチドについて行われた定量的構造活性相関研究はごくわずかです。 これは、これまでにレニン阻害活性を持つペプチドがほとんど発見されていないため、この領域の新規性が原因である可能性があります。 定量的構造活性相関分析の結果は、強力なレニン阻害活性を持つ生物活性ペプチドが、C末端に主にかさ高いアミノ酸（トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニン）を含むことを示しました。 N末端には疎水性の小さなアミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン）があります。 生物活性ペプチドのC末端にトリプトファンが存在することは、それらのレニン阻害活性に影響を与える重要な要因であると予測されています。 この主張を確認するために、4つの小さな生物活性ペプチド（LW、IW、AW、およびVW）が、それらの予測される強力なレニン阻害活性のためにさらに研究されました。 これらの生物学的活動は、AWとVWでは実験的に確認できませんでした。しかし、ペプチドLWとIWはレニンの強力な阻害剤として確認されました[128,140]。 |
| 8.生物活性ペプチドに対する消化管消化の影響 |
| 消化管（GIT）では、乳製品の生物活性ペプチドは、内因性および微生物のプロテアーゼによってさらに加水分解される可能性があります。 生物活性ペプチドをより小さなペプチドと遊離アミノ酸に分解すると、これらの化合物のバイオアベイラビリティが向上します[141]。 ただし、この加水分解は、生物活性ペプチドの心臓保護効果を低下させる可能性があります[142]。 |
| 消化管を通過する乳製品の生物活性ペプチドの修飾の全範囲はまだ完全には理解されていません。 図4に示すように、胃腸ジュースや酵素の影響により、タンパク質や生理活性ペプチドの構造や生物活性に変化が生じる可能性があることを考慮する必要があります。 したがって、乳製品の胃腸消化は、元のタンパク質からの新しい生物活性ペプチドの生成または生物活性ペプチドのさらなる加水分解のいずれかによって、それらの生物学的活性に劇的に影響を及ぼし、消化前とは異なる生物学的効果を持つペプチド画分の放出につながる可能性があります [80,91,143]。 |
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| 図4 乳製品のタンパク質とペプチドに対する消化管の影響 |
| 胃腸消化に対する生物活性ペプチドの耐性には、疎水性、酸／塩基の性質、アミノ酸組成とペプチド配列、特にC末端またはN末端のアミノ酸残基の種類などのさまざまな要因が影響します[144]。 疎水性は生物活性ペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性の重要なパラメーターですが、この要因は胃腸消化に対する生物活性ペプチドの耐性に間接的に関連しています[145]。 胃腸消化中の親水性ペプチドの安定性の増加に関連する同様の結果がXieらによって報告されました。 [146]。 ミルクに由来する負に帯電したペプチドの生物活性は、消化管を通過し、続いて正に帯電した中性ペプチドを通過する間、よりよく保存されることも証明されています[145,147]。 消化管消化中に経口投与された生物活性ペプチドを保護し、それらの生物学的特性を保存するためのカプセル化法の開発は、有望な結果を示しています。 生物活性ペプチドのカプセル化方法には、タンパク質ベース、多糖類ベース、脂質ベースの3種類があります[148]。 マイクロエマルジョンおよび乳化マイクロエマルジョン、エマルジョン、固体脂質粒子、リポソーム、およびポリマーミクロゲルは、これまでのところ、生物活性ペプチドの保護のための十分に確立された戦略である[149]。 乳製品および乳製品由来のペプチドの場合、Zhang et al [150]は、胃腸消化中の保護と腸のバイオアベイラビリティを高めるために、乳製品由来のアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドRLSFNPをリポソームに封入しました。 |
| 9.生物活性ペプチドのアレルギー誘発性と毒性 |
| 免疫グロブリンE（IgE）を介した反応は、食物アレルギーの最も顕著な形態の1つです。 したがって、そのエピトープへの免疫グロブリンE結合の障害は、さまざまな化合物のアレルゲン性を低下させる可能性があります[151]。 これに基づいて、タンパク質加水分解、微生物発酵、加熱、照射、および高静水圧などの処理が現在、特定のアレルゲンの免疫反応性を軽減するために適用されています[152、153、154、155、156]。 |
| タンパク質加水分解は現在、食品業界で低アレルギー性ミルクフォーミュラを調製するために使用されています[155,157]。 粉ミルクは厳格な基準に従って製造されていますが、ペプチドの存在はアレルギー反応を刺激する可能性があります[158,159]。 NSAEPEQSLAC、GAQEQNQEQPIRCEKDERF、VRTPEVDDEALなどのいくつかのアレルゲンペプチドが、これらの低アレルゲン処方で発見されています[147,160]。 [161]によって行われた研究では、ミルクカゼインに由来する3つのペプチドが、マウス骨髄の肥満細胞アレルギーモデルを使用してアレルギー誘発性について分析されました。 肥満細胞とペプチドのインキュベーションの結果は、肥満細胞の脱顆粒のマーカーであるヒスタミンとトリプターゼの放出を示し、テストされたすべてのペプチドの中で、カソモルフィン-5は最大のアレルギー反応を示しました[161]。 |
| 心血管疾患を予防するための特定の合成薬の使用は、有害な二次的影響をもたらす可能性があるため、乳製品や生理活性ペプチドは、これらの病気に対する栄養補助食品として研究されてきました。 これまでに実施された毒物学的実験では、乳製品の生物活性ペプチドの毒性は見られませんでした[162,163,164,165]。 Maeno, Nakamura, Mennear および Bernard [163]は、生物活性ペプチドを含む発酵乳を投与した場合、ラットの生命または死後の生理学的または毒物学的変化はなかったと報告しました。 著者らは、4000 mg / kgを超える単回投与の最低観察可能効果レベル（LOEL）を高く評価し、反復投与の結果は、最低観察可能効果レベルの確立を支持する証拠がなく、標的臓器毒性の特定を支持しなかった。最大耐量（MTD）、両方とも最大28日間連続して2g /kg/日を超える[163]。 In vitro研究は、乳製品に影響された悪性細胞に由来する生物活性ペプチドが、正常な細胞株に害を及ぼさないことを示した[166]。 Gleeson et al [167]が行った研究では、β-カゼインから単離されたアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドであるIPPは、腸（Caco-2）および肝臓（HepG2）細胞株に対して細胞毒性を持たないことが明らかになりました。 |
| 10.生物活性ペプチドの法規制要件 |
| 機能性食品は、典型的な食事の特徴を超えて、人間の健康に強い影響を及ぼします。したがって、それらは健康的な食事の構成要素として消費されるべきです。 欧州連合（EU）では、新製品を販売する際に考慮すべき主要な規制の1つは、258/97/CEです[174]。 この規制は、1997年5月15日以前にEU内でかなりの程度まで人間の消費に使用されなかったものとして定義される「ノベルフード」の市場への配置の要件を確立します[174]。 EUでは、製品に健康と栄養を含む2つのクラスのクレームをタグ付けできます。 栄養強調表示のカテゴリは、低脂肪、高繊維製品などの優れた栄養特性に関して確立されており、健康を促進するビタミンやアミノ酸が豊富に含まれています。 食品/成分と人間の幸福との関係は、「健康強調表示」として表されます。 生理活性ペプチドに関連する健康強調表示を考慮すると、基本的な機能、病気のリスクの低減、そして最後に子供の健康の向上に関連する強調表示を含む3つの明確に区別された強調表示があります[175]。 健康を改善するための上記の健康強調表示は、免疫系機能の促進剤としての乳ペプチド[176]、コレステロールによって引き起こされる病気のリスクを下げるための卵ペプチド[177,178]、および子供の健康の発達のための魚ペプチドの場合によく認識されています。 [175,179]。 |
| クレームを確立し、食品への生物活性ペプチドの適用について承認を受けるには、この商品化に関心のある組織および企業は、EU加盟国を通じて欧州食品安全機関（EFSA）に要求を提出する必要があります。 その後、欧州食品安全機関のDietetic Products、Nutrition and Allergies（NDA）パネルは、ECの規制に基づいて、生物活性ペプチドと主張されている健康促進の可能性との関連を分析します（1924/2006）[180]、 消費者を保護しながら、EU内市場の効果的な機能を確保します。 次に、in vitroおよびin vivoの信頼性、効力、安全性、用量反応レベル、および製品の安定性を綿密に調査した後、これらの主張に関する決定が安定します。 生物活性ペプチドを含む製品の健康強調表示を確実にするために人間の臨床試験が必要であるということは、すべての関連する研究者と開発者の間の一般的な合意です。 さらに、欧州食品安全機関は食品に適用されたペプチドに関する情報を要求します。 これには、ペプチドの量、ペプチドの配列と長さ（ペプチド配列内のアミノ酸の数）、ペプチドのアミノ酸組成、分子量（MW）分布、生成手順、物理化学的特性、および製品を利用するための条件が含まれます[181]。 EUにおけるこれらの立法手続きの例として、LKPNMのペプチド配列でカツオから生成される血圧を下げる可能性のある心臓保護ペプチドを含む製品は、ヒトでの有効性の科学的証拠が不十分であるため、欧州食品安全機関によって拒否されました[182 ]。 |
| 欧州食品安全機関がペプチド含有製品を標準化するために重要な他のいくつかのパラメーターがあります。これには、図示された健康上の利益を達成するために不可欠な食品の量、誰が製品を使用すべきでないかについての自信のある主張、および過度の消費に関連する健康リスクについての注意通知[180]が含まれます。 一例として、強力なアンジオテンシン変換酵素阻害活性を持つイワシに由来する市場で入手可能なペプチド（Valtyron®）が欧州食品安全機関によって登録されました。 この製品には、一部の乳製品（発酵乳、ヨーグルト、粉末ミルク、ヨーグルトドリンクなど）および非乳製品（飲料、シチュー、スープ、朝食用シリアルなど）で1食あたりの最大消費量は0.6gの特定の使用を示すラベルを付ける必要があります。 |
| 健康に良い食品の最大の市場の1つであるアメリカ合衆国（USA）では、食品医薬品局（FDA）は、栄養補助食品の完全な定義を「次の食事成分の1つまたは複数を含むまたは含む食事を補うことを目的とした製品（タバコ以外）」と規定しています。 （A）ビタミン; （B）ミネラル; （C）ハーブまたは他の植物; （D）アミノ酸; （E）総食事摂取量を増やすことによって食事を補うために人間が使用する食事物質。 または（F）条項（A）、（B）、（C）、（D）、または（E）に記載されている成分の濃縮物、代謝物、成分、抽出物、または組み合わせ」（FDA 1994）。 「機能性食品」または「栄養補助食品」という用語は、法律で具体的に定義されていなくても、連邦食品医薬品化粧品法の権限の下で規制されている食品です[183]。 |
| 日本の場合、この国は機能性食品の商品化を許可する世界初の政策であるFOSHU（特定の健康用食品）を持っています。 この用語を承認した厚生労働省によって1991年に設立されたFOSHUは、健康強調表示を裏付ける十分な科学的証拠がある食品を指定するために正式に使用されています[184]。 FOSHUの承認の全体的なプロセスは図5に要約されています。 |
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図5 特定保健食品の承認手続きの概要。 日本の厚生労働省から変更された画像の内容[185]。 |
| 日本では、特定保健食品（FOSHU）によって承認された生物活性ペプチドを含むいくつかの市販の機能性製品があります。 これらの製品には、サワーミルク、ミルクカゼイン加水分解物、鰹節オリゴペプチド、ブナハリタケ（Mycoleptodonoide saitchisonii）抽出物、イワシ、海藻、ゴマ由来の生理活性ペプチドが含まれ、すべてアンジオテンシン変換酵素阻害による心臓保護効果があります。 私たちの知る限りでは、表5にリストされている、ミルクに由来する心臓保護ペプチドを含むいくつかの製品があります。 これらの降圧ペプチドの正確なメカニズムと摂取効率を明らかにするには、さらに研究が必要です[186]。 |
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| 11. 将来の展望と結論 |
| さまざまな研究で提供されている現在の科学的証拠に基づいて、牛、山羊、ラクダなどの複数の動物種からのミルクは、ミルクの直接処理（発酵および酵素加水分解）またはより複雑なヨーグルト、チーズ、ケフィアの製造などのプロセスによって複数の心臓保護ペプチドを生成する可能性があります。 起源の動物種、ならびに製品の処理および保管は、これらの製品に存在するペプチドの変動性、したがってそれらの生物学的および心臓保護特性に寄与するであろう。 |
| 複数の乳製品に含まれる生理活性ペプチドの存在を評価し、同定されたペプチド配列に対する胃腸消化の影響を評価するには、さらなる研究も必要です。 さまざまなペプチドの消化管消化により、バイオアベイラビリティが向上する可能性のある小さなペプチド配列が得られます[141]が、これらの化合物の生物学的特性は変化するか、さらには低下する可能性があります[142]。 臨床試験を含むin vitro、ex vivoおよびin vivoモデルを使用した同定されたペプチドの心臓保護効果の評価は、これらのペプチドとそれらの標的分子との構造－機能関係を理解するために重要であり、 世界中で利用可能なさまざまな法的枠組みの仕様に従って製品を販売するための明確な健康強調表示を確立するために、企業と生産者を支援します。 |
| 全体として、これらの化合物の毒性とアレルギー誘発性に関するさらなる研究は、各特定の製品の安全性と、安全な商品化を目指した推奨/許容摂取量を確立するために依然として必要ですが、これまでに評価されたいくつかのミルク由来ペプチドは安全であることが示されています 、生物活性ペプチドを含むミルク由来製品の開発とさらなる評価のための有望なシナリオを開きます。 |
参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
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この文献は、Foods. 2022 May; 11(9): 1270.に掲載されたCardioprotective Peptides from Milk Processing and Dairy Products: From Bioactivity to Final Products including Commercialization and Legislation を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |
