腸内細菌

お電話でのお問合せ

0120-417-918

ヨイナケヒヤ

更新2021.01.27

HOME＞文献調査＞腸内細菌

4.4.2

文献調査（発酵乳、腸内細菌の科学：研究の最前線）

酵母は窒素のオーバーフローを通じて、共生する乳酸菌のためのニッチを創出する

Katharina Zirngibl et al.,

Cell Syst. 2017 Oct 25;5(4):345–357.e6.

要約

　多くの微生物は群集を形成して生息し、生存のために群集内の他の微生物が分泌する代謝産物に依存している。しかし、種間代謝依存性に関する知見は、交換される代謝産物の数が少ない少数の群集に限られており、代謝交換を促進する細胞制御機構についてはさらに不明な点が多い。本研究では、酵母が容易に確立された群集において、内因性の多成分相互栄養供給を介して乳酸菌の増殖をどのように促進するかを示す。窒素が豊富な環境下では、Saccharomyces cerevisiaeは代謝産物、特にアミノ酸を分泌することで代謝を調節し、それによってLactobacillus plantarumとLactococcus lactisの生存を可能にする。利用可能な窒素源の量と窒素代謝抑制経路の状態が、このニッチ形成を共同で調節する。本研究では、ブドウ果汁中で酵母による窒素過剰供給がLactobacillus plantarumに利益をもたらし、乳糖を含む培地中でLactococcus lactisとの共生関係の出現に寄与することを示す。私たちの研究結果は、ある種の代謝に関する意思決定が、他の種にどのように利益をもたらすかを示している。

グラフィカルアブストラクト

ハイライト

• 酵母は、乳酸菌の生存を可能にするアミノ酸を過剰に放出する

• 放出量は窒素の過剰量に比例し、TORC1経路を介して制御される

• 乳糖が主要な炭素源である場合、酵母と乳酸菌の間に相利共生関係が容易に成立する

　酵母と乳酸菌は、様々な自然発酵食品や飲料において共存しています。我々は、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、および遺伝学的解析を用い、酵母による窒素の過剰放出（窒素オーバーフロー）がいかにして乳酸菌に利益をもたらし、相利共生の成立に寄与するのかを明らかにします。

目次(クリックして記事にアクセスできます）

1.はじめに

2.結果

　2.1.酵母は安定した3種共存系における乳酸菌の増殖を可能にする

　2.2.酵母と乳酸菌の相互作用は低分子化合物によって媒介される

　2.3.ゲノムスケール・コミュニティ代謝モデルによるアミノ酸のクロスフィーディング（相互供給）の予測

　2.4.細胞外メタボロームの動態解析により、多成分にわたるクロスフィーディングが明らかに

　2.5.アミノ酸は酵母と乳酸菌の相互作用における主要な因子である

　2.6.TORC1経路とNCR遺伝子が酵母と乳酸菌の相互作用に及ぼす影響

　2.7.乳酸菌の増殖を異なる度合いで促進する酵母株間では、アミノ酸の分泌パターンが異なる

　2.8.酵母によるアミノ酸の分泌には豊富な窒素源が必要である

　2.9.生態学的文脈における酵母と乳酸菌の共生

3.考察

4.STAR★方法

　4.1.主要リソース一覧表

　4.2.試薬およびリソースの共有に関する連絡先

　4.3.実験モデルおよび供試株の詳細

　　4.3.1.菌株、培地、および培養条件

　　　4.4.1.1コロニー形成単位（CFU）の計数

　　4.4.2.種特異的qPCR

　　4.4.3.フローサイトメトリー

　　4.4.4.酵母細胞の死滅および損傷の評価

　　4.4.5.非標的型エクソメタボローム解析

　　4.4.6.RNA抽出、シーケンシング、およびデータ解析

　　4.4.7.微生物群集におけるクロスフィーディングの代謝モデリング

　　4.4.8.アミノ酸の定量（LC-MS）

　　4.4.9.アミノ酸および乳糖の定量（GC-MS）

　　4.4.10.アミノ酸およびポリアミンの検出（UPLC）

　　4.4.11.分岐鎖α-ケト酸の測定

　4.5.定量および統計解析

　　4.5.1.アミノ酸漏出量の推定

　　4.5.2.統計解析

本文

1.はじめに

　種間における代謝産物のやり取りが果たす生態学的に極めて重要な役割の一つに、栄養素のクロスフィーディング（相互供給）があります。こうした栄養相互作用（食物連鎖）は、限られた資源の中で複数の生物群が生存することを可能にし、群集の多様性を高め、さらには地球規模での元素循環を駆動します。例えば、メタン生成を行う嫌気性微生物コンソーシアムにおいて、メタン生成菌は一次発酵菌から供給される電子キャリア（水素、酢酸、ギ酸、二酸化炭素など）に依存しています（Embree et al., 2015; Morris et al., 2013; Stams, 1994; Tveit et al., 2015）。また、ヒトの腸内共生細菌は、群集内の他のメンバーと中間代謝産物を共有することで、複雑な食事由来の多糖類を段階的に分解・利用しています（Koropatkin et al., 2012; Rakoff-Nahoum et al., 2014; Rios-Covian et al., 2015）。さらに、土壌細菌は、群集内の他のメンバーが利用可能な多種多様な代謝産物を分泌しています（Baran et al., 2015）。近年の研究（Hom and Murray, 2014）で示されているように、こうした共生的な代謝相互作用は、異なる種の栄養要求性と生合成能力の適合性によって容易に成立し得ます。したがって、個々の種の生存は、他者の代謝活動によって創出されるニッチ（生態的地位）に依存している場合が多いのです。

　複雑な自然環境下で代謝産物のやり取りを検出する際の課題を回避するため、代謝的相互作用の詳細は通常、人工的な微生物群集を用いて詳細に解析されます。こうした群集は、既知の、あるいは進化や遺伝子工学によって改変された代謝的相互作用を利用して構築されることが多く（Andrade-Dominguez et al., 2014; Hom and Murray, 2014; Kosina et al., 2016; Mee et al., 2014; Miller et al., 2010; Wintermute and Silver, 2010; Zhou et al., 2015）、種間依存性の原理やメカニズムに関する知見をもたらしてきました（De Roy et al., 2014; Ponomarova and Patil, 2015; Song et al., 2014）。しかし、自然選択や人為的な改変を経ているため、こうした群集におけるクロスフィーディング（代謝産物の相互供給）は少数の代謝産物に限定されており、自然界で見られる相互作用の複雑さを必ずしも反映していない可能性があります。さらに、種間での代謝産物交換の基盤となる有用な代謝産物を、微生物が分泌するに至る制御上の判断については、ほとんど解明されていません。

　本論文では、内在的な代謝依存関係を有する酵母と片利共生的な乳酸菌からなる安定した群集の「デノボ（新規）」構築について報告する。我々はこの群集を用いて、新規の代謝物交換を特定し、一方的な関係から相利共生的なクロスフィーディング（代謝産物の相互利用）へと移行する様子を実証する。さらに、おそらく最も重要な点として、自然界における相互作用が本来持つ複雑さと、その制御の基盤となる仕組みを捉えます。

2.結果

2.1.酵母は安定した3種共存系における乳酸菌の増殖を可能にする

　代謝的相互作用を検出し研究するためのモデル系として、我々は野生型のSaccharomyces cerevisiae、Lactococcus lactis、およびLactobacillus plantarumを用いた3種共存系の構築を試みた。これらの菌種を選定したのは、ケフィア、キムチ、ワイン、サワードウ、ココアなど、様々な自然発酵食品や飲料において、酵母と乳酸菌の共生が繰り返し見られることに着想を得たためである（Blandino et al., 2003; Di Cagno et al., 2014; Lee et al., 2015; Lonvaud-Funel, 2015; Papalexandratou and Nielsen, 2016; Prado et al., 2015; Tamang et al., 2016）。さらに、こうした環境下における酵母と乳酸菌の間の代謝的相互作用については、以前からその存在が示唆されており（Gobbetti et al., 1995）、いくつかの菌種において実際に観察されている（Mendes et al., 2013; Narvhus, 2003; Stadie et al., 2013）。

　特定の酵母と乳酸菌の種間で起こりうる代謝的依存関係を調べるため、我々はまず、これら3種の微生物のいずれかが共培養によって増殖の促進を示すかどうかを検討した。栄養組成の異なる複数の化学的に定義された培地（CDM）を用い、単独培養および共培養における3種すべての増殖を評価した。酵母は比較的単純な培地でも増殖できるのに対し、乳酸菌は栄養要求性が高く、アミノ酸やビタミンなど、より多くの栄養素を必要とする。増殖を促進する代謝産物のやり取りを検出するための培地は、栄養の「欠乏」と「豊富さ」のバランスが取れている必要がある。すなわち、微生物群の構成員間でやり取りされうる成分（およびその代謝的等価物）は含まない一方で、3種すべての増殖を支えるのに十分な栄養を含んでいなければならない。そこで、まず3種の増殖に必要なすべての成分を含む栄養豊富な培地を用意し、そこから特定の成分や成分群を除去した様々な培地を調製した。これらの培地を用いて、単独培養では増殖しないものの共培養では増殖する（すなわち栄養の相互供給＝クロスフィーディングが示唆される）条件を探索した。試験した培地のうち、35種類の成分を含む培地（CDM35；表S1参照。8種類のアミノ酸［アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、チロシン］および窒素源としてのアンモニウム塩を含む）がこの要件を満たし、酵母と両乳酸菌種との間の相互作用が明らかになった。CDM35において、酵母の増殖は単独培養と乳酸菌との共培養の間でほとんど差が見られなかったが、L. lactisおよびL. plantarumはいずれも、液体培地および固体培地の両方において、酵母と共培養した場合にのみ増殖が可能であった。このことは、代謝的依存関係の存在を示唆している（図1A～1C）。

図1. S. cerevisiaeは乳酸菌の増殖を可能にする

(A) 単独培養および混合培養におけるS. cerevisiae、L. lactis、およびL. plantarumのコロニー形成単位（CFU）の定量（24時間後；生物学的反復n=3の技術的反復を統合）。

(B) S. cerevisiaeとの共培養（色付きの線）および単独培養（灰色の線）におけるL. plantarumとL. lactisの増殖動態。データは3つの生物学的反復の平均値±標準偏差（SD）として表示。

(D) 毎日継代を行い2週間経過した後の、単独培養および混合培養におけるS. cerevisiae、L. lactis、およびL. plantarumのコロニー形成単位の定量（生物学的反復n=3の技術的反復を統合）。図S1も参照のこと。

(E) 酵母細胞密度で正規化した、酵母馴化培地が乳酸菌に及ぼす影響。棒グラフは平均値を示し、点は少なくとも4回の独立した実験から得られた技術的反復を統合したもの。

　我々は、酵母と乳酸菌を新鮮な培地へ毎日植え継ぎながら2週間以上にわたって長期共培養を行い、この正の相互作用の安定性を検証した。植え継ぎ終了時にコロニー形成単位（CFU）に基づいて定量を行ったところ、酵母の存在下では両方の乳酸菌が生存し続けており、中でもL. lactisが当該菌群の中で最も高い存在量を示した（図1D）。特筆すべきことに、単独培養の系ではいずれの乳酸菌も検出されず、それらは酵母との共培養下でのみ生存可能であった。このような酵母と乳酸菌からなる菌群の安定性は、50日以上にわたる毎日の植え継ぎや、1週間にわたる連続共培養においても同様に確認された（図S1）。

2.2.酵母と乳酸菌の相互作用は低分子化合物によって媒介される

　酵母と乳酸菌の相互作用が代謝的な性質に基づくものであることを確認するため、まず、酵母の培養上清（酵母培養液から菌体を除去したろ液）のみで乳酸菌の増殖が維持されるかどうかを調べた。その結果、L. lactis と L. plantarum はいずれもこの培養上清中で良好に増殖し、共培養時と同様の効果が再現された（図1E）。この結果は以下のことを示している。(1) 酵母は乳酸菌の増殖を維持する拡散性の因子を産生する、(2) 相互作用に酵母と乳酸菌の直接的な物理的接触は必要ない、(3) 増殖促進因子の放出は酵母の単独培養における固有の性質であり、細菌による誘導を必要としない。乳酸菌に対する酵母の影響は、pHの変化によるものではなかった。さらに、酵母培養上清中で乳酸菌の増殖を可能にする因子は、プロテアーゼ処理に対して安定であり、陰イオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーにおいてフロースルー画分（非吸着画分）に回収され、3 kDaのフィルターを通過し、アセトンで沈殿し、アセトニトリルでは部分的に抽出されるものの低極性有機溶媒では抽出されないことが明らかになった。これらの特性は、酵母と乳酸菌の相互作用を媒介する物質が、低分子かつ親水性の代謝産物であることを示唆している。

2.3.ゲノムスケール・コミュニティ代謝モデルによるアミノ酸のクロスフィーディング（相互供給）の予測

　交換され得る代謝産物の性質をさらに詳細に調べるため、我々はゲノムスケール代謝モデリングの手法（Zelezniak et al., 2015）（STAR Methods）を用い、3種の微生物からなるコミュニティにおける代謝産物の交換をシミュレーションした。具体的には、3種の個別の代謝モデルを統合してコミュニティモデルを構築し、その際、環境からの栄養素の供給量をCDM35培地の組成に基づいて制限した。次いで、混合整数線形計画法を用いて、3種すべての増殖を維持し得るあらゆる代謝産物交換のパターンを網羅的に特定した。実験での観察結果と同様に、2種の乳酸菌のモデルは、酵母からの代謝的な供給なしには増殖（すなわち、細胞増殖に必要な構成成分や補因子の産生）が不可能であることが示された。特に、コミュニティモデルは、酵母から細菌へとアミノ酸（グルタミン、グルタミン酸、プロリン、フェニルアラニン）が供給される経路を予測した（図S2）。さらに、L. plantarumに関しては、アミノ酸生合成における様々なアミノ基転移反応の共基質である2-オキソグルタル酸や、ポリアミンの一種であるスペルミジンの供給も予測された。これらの結果は、窒素化合物、とりわけアミノ酸が、交換される代謝産物の候補であることを示唆している。

2.4.細胞外メタボロームの動態解析により、多成分にわたるクロスフィーディングが明らかに

　交換される代謝産物を実験的に特定するため、前述の馴化培地（酵母培養後の培地）を用いる手法と、非標的型質量分析法（Fuhrer et al., 2011）を組み合わせました。馴化培地を用いることで、乳酸菌による取り込みの前にクロスフィーディング分子を蓄積させることができ、低濃度かつ一過性に交換される代謝産物の検出に伴う困難を回避できました。同時に、質量分析法を用いることで、分泌・取り込みされる多数の化合物の動態をプロファイリングすることが可能になりました。酵母による培地のコンディショニング中、およびその後の馴化培地中での乳酸菌の増殖中に、複数の時点で上清サンプルを採取しました（図2Aおよび2B）。質量分析解析の結果、数百種類のイオンについて多様かつ動的なプロファイルが明らかになり、酵母と乳酸菌の間の複雑な細胞外メタボロームの特徴が示されました（図2C）。合計で10,620種類の代謝産物イオンが検出され、精密質量に基づいて2,225種類の代謝産物へと推定的にアノテーション（同定）されました（STAR Methods、表S2）。S. cerevisiaeの増殖に伴って蓄積し、細菌の増殖中に枯渇することで特徴的な釣鐘型のプロファイルを示す代謝産物（図2Cの赤色クラスター）を、酵母と乳酸菌の相互作用を媒介する候補として選定しました。このクラスターには交換される化合物の候補が多数含まれており、そのうちL. plantarumに対しては9種類、L. lactisに対しては11種類のイオンが、蓄積および枯渇の過程で2倍以上の変化を示しました（図2DおよびS3）。これらの多くはアミノ酸としてアノテーションされ、L. lactisへのグルタミンとスレオニンの供給、およびL. plantarumへのグルタミン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリンの供給といったクロスフィーディングの存在が示唆されました。また、代謝モデリングで予測された通り、2-オキソグルタル酸のクロスフィーディングも観察されました。以上のことから、非標的型細胞外メタボローム解析により、乳酸菌の酵母への依存性は多成分のクロスフィーディングによって媒介されていることが示唆されました。さらに本解析は、同定の確定、定量、および乳酸菌の増殖を支える能力の検証を行うための、さらなる解析対象となる候補代謝産物を提示するものでもあります。

図2. 乳酸菌の増殖を可能にする酵母分泌物成分の同定

(A) 馴化培地を用いたアッセイの設計。

(B) 馴化培地アッセイに適用した、非標的メタボロミクス（フローインジェクション分析・飛行時間型質量分析［FIA-TOF MS］）のワークフロー。

(C) 非標的メタボロミクスにより明らかになった、S. cerevisiaeおよび L. plantarumの細胞外メタボローム動態。異なるプロファイル形状を示すイオン群が示されている。酵母から細菌へクロスフィーディング（代謝産物の相互供給）されている可能性のある代謝産物群（ベル型の曲線）を赤色で強調表示した。1サンプルのデータを示している（要約統計量については図S3も参照）。

(D) S. cerevisiae によって産生され、乳酸菌によって消費される代謝産物（蓄積および減少のいずれにおいても2倍以上の変化が見られたもの）。図S3も参照のこと。なお、精密質量に基づくイオンの同定（アノテーション）は不確定な場合があるため、完全な同定結果については表S2を参照すること。

2.5.アミノ酸は酵母と乳酸菌の相互作用における主要な因子である

　細胞外メタボローム動態解析から示唆された代謝産物の候補に基づき、我々は標的型液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（Mülleder et al., 2016a）を用いて、酵母が分泌するアミノ酸を定量した。酵母培養液中の細胞外アミノ酸濃度は細胞密度に比例して増加し、定常期には一定の値で安定した（図3A）。これと一致して、異なる増殖段階で調製した馴化培地は、増殖初期段階のものであっても細菌の増殖を促進した（図S4）。これらの観察結果は、増殖を促進する成分が細胞の溶菌によって放出されたものではなく、代謝的に活性な細胞によって産生されたものであることを示唆している。さらに、死細胞や損傷細胞の割合は極めて低く（約0.04%、STAR Methods）、馴化培地で観測されたアミノ酸濃度をそれらだけで説明することはできない（STAR Methods）。このことは、酵母の細胞外メタボロームが細胞の溶菌に由来するものではないことを示した先行研究（Campbell et al., 2015; Paczia et al., 2012）と整合する。酵母馴化培地中に最も多く蓄積したアミノ酸は、トレオニン、グルタミン、アラニン、グルタミン酸、セリン、およびグリシンであった（図3B）。したがって、標的型メタボロミクスの結果は非標的型細胞外メタボロミクスの結果とよく一致しており、アミノ酸の交換、特にグルタミンとグルタミン酸のクロスフィーディング（相互栄養供給）が行われていることが確認された。

図3. S. cerevisiaeが分泌するアミノ酸とラパマイシンの影響

(A) S. cerevisiae の細胞外メタボロームにおける分泌アミノ酸の動態。黒線は酵母の細胞密度を示し、エラーバーは平均値 ± 標準偏差（SD）（n = 4、生物学的反復）を表す。図S4も参照のこと。

(B) 酵母馴化培地（600 nmにおける吸光度 [OD600] ∼ 1 の時点）中の分泌アミノ酸濃度。データは平均値 ± SD（n = 4、生物学的反復）として示されている。

(C) 同定されたアミノ酸を（それぞれの濃度で）未処理培地に添加した際の L. lactis の増殖への影響。データは、3つの生物学的反復における平均値および統合された技術的反復として示されている。L. plantarum のデータについては図S5を参照のこと。

(D) ラパマイシン存在下で酵母を培養した際の、それぞれの馴化培地における乳酸菌の増殖への影響。データは、3つの生物学的反復における平均値および統合された技術的反復として示されている。

(E) ラパマイシン存在下で培養した際の酵母馴化培地の細胞外メタボロームの変化（非標的メタボロミクスによる推定）。データは、対応する酵母培養液の曲線下面積（AUC）によって正規化されている。赤色は q 値（偽発見率で補正された t 検定由来の p 値）が 0.1 未満であることを示す（n = 3、生物学的反復）。ラパマイシン存在下で酵母から細菌へクロスフィーディング（代謝産物の供給）される代謝産物（ベル型のプロファイルを示すもの）については図S6を参照のこと。

　さらに、未処理の培地にこれらのアミノ酸を観測された濃度で添加することで、コンディションド培地（酵母培養後の培地）が持つ増殖促進効果を再現できるかどうかを検討しました。その結果、特定されたアミノ酸は、L. lactis の増殖をコンディションド培地と同等のレベルまで完全に回復させました（図3C）。特に、グルタミンとセリンはL. lactis の増殖に必須かつ十分であり、両者の間に相乗効果が認められました。コンディションド培地と比較して、アミノ酸を添加した培地で L. lactis の増殖がわずかに高かったのは（図3C）、酵母による培地成分の枯渇や、エタノールなど分泌された他の化合物による増殖抑制作用が原因であると考えられます。したがって、エキソメタボロームの動態が示唆するように、酵母馴化培地に含まれるその他の代謝産物もまた、L. lactis の増殖に寄与している可能性があります。

　L. plantarumの場合、CDM35培地への定量されたアミノ酸の添加は、その増殖に対してわずかな効果しか示しませんでした（図S5）。しかし、特定されたアミノ酸以外にも、多くの代謝産物がL. plantarumの増殖を支えている可能性があります。このような多成分によるクロスフィーディング（代謝産物の相互供給）は相乗的に作用するため、その特性を解明することは困難を伴います。なぜなら、単一の代謝産物を除くだけで、その効果全体が失われてしまう可能性があるからです。アミノ酸以外にどのような酵母由来の細胞外代謝産物がL. plantarumの増殖維持に関与しているかを調べるため、我々はいくつかの化合物を試験しました。それらには、馴化培地で検出された化合物（2-オキソグルタル酸およびプトレシン：表S3）、非標的メタボロミクスで特定された化合物（トリプトファン、フェニルアラニン、および2-オキソグルタル酸）、モデリングにより予測された化合物（フェニルアラニンおよび2-オキソグルタル酸）、あるいは既知の乳酸菌の生理学的特性に基づいて仮説が立てられた化合物（核酸塩基およびアスコルビン酸：図S5）が含まれます。実際、予測または仮説に基づいた化合物のいくつかの組み合わせが、馴化培地で特定されたアミノ酸と相乗的に作用し、効果を示すことが明らかになりました。試験した特定の代謝産物そのものは馴化培地では特定されませんでしたが、関与している未知のクロスフィーディング化合物は、特定された有効成分（エフェクター）の栄養学的アナログである可能性があります（例：フェニルアラニンやトリプトファンの代わりとなる短鎖ペプチドなど）。

２.６.TORC１経路とNCR遺伝子が酵母と乳酸菌の相互作用に及ぼす影響

　次に、我々は、乳酸菌の増殖を可能にする栄養素を酵母に分泌させる制御プロセスについて調査を試みた。細胞代謝はしばしば栄養シグナルに応答して制御されるため、我々は、真核細胞における主要な栄養感知・制御因子であるTORC1（訳者注：TORC1（ラパマイシン標的タンパク質複合体1）は、栄養やエネルギーの状態を感知して細胞の成長や代謝を調節する、真核生物に広く保存された重要なタンパク質キナーゼ複合体です）の関与を仮説として立てた。実際、TORC1の特異的阻害剤であるラパマイシンの存在下では、L. lactisおよびL. plantarumに対する酵母馴化培地の促進効果が最大5倍にまで増強された（図3D）。これと整合するように、非標的エクソメタボローム解析の結果、ラパマイシン存在下では複数の代謝産物、特にアミノ酸であるグルタミンとアスパラギンの分泌量が増加していることが示された（図3E）。非標的解析においてベル型（山型）のプロファイルとして検出された交換代謝産物についても、その大部分は共通していた（図S6）。

　TORC1は栄養シグナルに応答して、増殖、オートファジー、タンパク質合成、窒素代謝など、広範な細胞プロセスを制御しています（Broach, 2012; Conrad et al., 2014; Loewith and Hall, 2011; Zaman et al., 2008）。酵母と乳酸菌の相互作用にどのTORC1関連プロセスが関与しているかを明らかにするため、我々はS. cerevisiaeの82種類の単一遺伝子欠損株を対象に、乳酸菌の増殖を支持する能力を調べました。これらの遺伝子は、TORC1複合体の上流および下流に位置するTORC1シグナル伝達の主要なエフェクターを網羅するように選定されました（Conrad et al., 2014; De Virgilio and Loewith, 2006; Fayyadkazan et al., 2014; Loewith and Hall, 2011）（表S5）。選定された遺伝子には、転写因子やその他の制御タンパク質に加え、アミノ酸代謝に関与する酵素やトランスポーターが含まれていました。アミノ酸の外部添加に依存することなく酵母を培養し、かつ栄養要求性マーカーによる生理学的影響を回避するため（Alam et al., 2016）、すべての株はプロトトロフ（栄養要求性を持たない野生型）の欠損株ライブラリーから入手しました（Mülleder et al., 2012）。CDM35培地で増殖した51種類の欠損変異株のうち、7種類は乳酸菌の増殖を著しく促進し、2種類は抑制しました（図4A、表S5）。これら9種類のエフェクターはいずれも転写因子またはシグナル伝達タンパク質であり、酵母と乳酸菌の相互作用が複雑な表現型であることを示唆しています。この相互作用を変化させるには、多面的な（pleiotropic）作用が必要であると考えられます。乳酸菌の増殖を促進した欠損株（ure2Δ、gtr1Δ、pep3Δ、gcn1Δ、alt1Δ、lst4Δ、ego3Δ）は、L. lactisとL. plantarumの双方に対して同様の影響を及ぼしました。転写因子をコードする2つの遺伝子（GLN3またはDAL81）のいずれかを欠損させると、L. lactisの増殖は有意に低下しましたが（p < 0.001）、L. plantarumの増殖を低下させたのはDAL81の欠損のみでした（p < 0.001）。この違いは、これら2種の乳酸菌がそれぞれ異なる代謝産物を介して酵母に依存していることを改めて示唆しています。

図4.酵母のノックアウト株解析により、NCR感受性遺伝子が乳酸菌との相互作用の制御因子であることが示唆された

(A) TORC1経路関連の単一遺伝子ノックアウト株が乳酸菌の増殖に及ぼす影響（野生株との比較）。表S5も参照のこと。

(B) 文献調査に基づく、酵母と乳酸菌の相互作用に影響を及ぼすNCR/TORC1制御因子の相互作用。緑色は、対応する遺伝子のノックアウトによって乳酸菌に対する酵母の影響が低下するタンパク質を示し、赤色は、欠損によって正の影響が生じるエフェクターを示す。

(D) ノックアウト酵母株の細胞外メタボロームにおけるアミノ酸濃度。∗p < 0.01、°p < 0.05。データは平均値 ± 標準偏差（SD）で表示（n = 4、生物学的反復）。図S7も参照のこと。

(E) L. lactisの増殖と相関する遺伝子が濃縮された遺伝子セット（選択された4つのノックアウト株と野生株全体での解析）。濃縮のp値が0.01未満のグループを表示（STAR Methodsを参照）。各セットの遺伝子数を括弧内に示す。

(F) L. plantarumについて(E)と同様の解析。濃縮のp値が0.01未満の、重複しない上位10グループを表示。 (G) 選択されたノックアウト株におけるNCR遺伝子（Ljungdahl and Daignan-Fornier, 2012）の発現（野生株に対するlog2倍率変化、n = 4、生物学的反復）。アミノ酸およびペプチド輸送体は太字で示す。

　特筆すべきことに、欠失によって乳酸菌の増殖を促進する遺伝子の多くは、Gln3pおよびDal81pの直接的または間接的なリプレッサー（抑制因子）をコードしています（Conrad et al., 2014; Loewith and Hall, 2011; Smets et al., 2010）（図4B）。Gln3pとDal81pはどちらも、窒素源を選択的に利用するプロセスである「窒素異化産物抑制（NCR）」の主要な制御因子です（Cooper et al., 1990; Cooper, 2002; Hofman-Bang, 1999; Rai et al., 2013）。グルタミンのような好ましい窒素源が存在する場合、酵母はその利用を優先し、他の窒素源の取り込みや異化を停止させます。この状態では、NCR感受性遺伝子の発現は抑制されます。逆に、プロリンのような好ましくない窒素源で酵母を増殖させる場合、細胞はNCR関連遺伝子を活性化し、代替の代謝経路を通じて利用可能な窒素化合物を同化します。Gln3pとDal81pは、透過酵素（パーミアーゼ）、異化酵素、およびその他の転写因子の誘導を介して、このプロセスを正に制御しています（Abdel-Sater et al., 2004; André et al., 1995; Bricmont et al., 1991; Cardillo et al., 2010）。酵母変異株の表現型は、NCR経路が乳酸菌のためのニッチ（生育環境）を形成する代謝産物の分泌をも媒介していることを示唆しています。

2.7.乳酸菌の増殖を異なる度合いで促進する酵母株間では、アミノ酸の分泌パターンが異なる

　酵母の代謝産物分泌の制御機構をより深く理解するため、乳酸菌の増殖を抑制する2株（gln3Δおよびdal81Δ）と促進する2株（ure2Δおよびgtr1Δ）という、計4種類の酵母ノックアウト株のアミノ酸分泌プロファイルを比較しました。まず、網羅的に作製されたライブラリー株で得られた結果が人為的なものではないことを確認するため、より安定したプロトトロフ（栄養要求性を持たない）のS90株を背景として、これら4種類の株を新たに構築しました（STAR Methods）。これら新規に作製した欠失変異株においても、当該遺伝子が乳酸菌の増殖に及ぼす影響が確認されました（図4C）。また、変異株が細菌の増殖に及ぼす影響が、酵母自身の増殖速度の違いによるものではないこと（図S7A）、および細胞の損傷や溶菌の程度が低いこと（最大0.22%；図S7BおよびS7C）も確認しました。

　酵母ノックアウト株がL. lactisの増殖に及ぼす影響は、対応する馴化培地中の総アミノ酸濃度と良好な相関を示し（rho = 0.9, p = 0.0416）、特にグルタミンの寄与が顕著でした（rho = 1, p = 0.0083）（図4D）。一方、L. plantarumの場合、gln3Δ株におけるアミノ酸濃度の低下は、同株の増殖増加とは矛盾する結果でした。このことは、アミノ酸以外の代謝産物のやり取りが関与していることを示唆しています。ure2Δ変異株およびgtr1Δ変異株は野生株よりも多くのアミノ酸を排出しており、特にure2Δ株ではアスパラギン酸とグルタミンの分泌量が劇的に増加していました。Ure2pとTORC1との間の制御関係と整合するように、ラパマイシン処理を行った酵母の細胞外メタボロームにおいても、これらと同様の代謝産物が顕著に増加しました（図3E）。さらに、細胞内アミノ酸レベルを対象とした最近のゲノムワイド・スクリーニング（Mülleder et al., 2016b）において、ure2Δ変異株はグルタミンを最も多く蓄積する株であることが明らかになっています（中央値の3.4倍に増加、p < 1.6 × 10⁻⁶⁹）。

　ノックアウト株のセクレトーム（分泌タンパク質・代謝産物群）の全体的な変化から、NCR（窒素異化代謝産物抑制）感受性遺伝子の正の制御因子（GLN3およびDAL81）の作用はアミノ酸分泌の増加と関連しており、逆にNCRの阻害因子（URE2およびGTR1）はアミノ酸分泌を抑制していることが示唆されました。さらに我々は、酵母が乳酸菌の増殖を促進する効果と正の相関を示す発現パターンを持つ遺伝子群を特定しました。そのために、酵母欠失株における遺伝子発現と、それらの株の培養上清（馴化培地）中で培養した細菌の最終的な600 nmにおける吸光度（OD600）との間で高い相関を示す遺伝子を対象に、パスウェイエンリッチメント解析を行いました。実際、NCR感受性遺伝子の発現レベルは、L. lactisおよびL. plantarumの増殖との正の相関において上位に位置していました（図4Eおよび4F）。これらの遺伝子は、最も多くのアミノ酸を分泌し、共生する乳酸菌の菌数を最も高く維持するure2Δ株において、最高の発現レベルを示しました（図4G）。興味深いことに、NCRによって制御される酵母のアミノ酸輸送体の一部（Ljungdahl and Daignan-Fornier, 2012による）の発現もまた、L. lactisの増殖と相関していることが明らかになりました。したがって、L. lactisの増殖を可能にするアミノ酸の分泌は、NCR経路を介して制御されていると考えられます。

2.8.酵母によるアミノ酸の分泌には豊富な窒素源が必要である

　我々は、酵母によるアミノ酸の分泌が培地中の総窒素濃度に依存すると仮説を立てた。これを検証するため、CDM35中の窒素化合物の濃度を段階的に低下させ、それらの馴化培地に含まれるアミノ酸を測定した（表S7参照）。その結果、利用可能な窒素の減少に比例して、総アミノ酸分泌量も減少することが確認された（図5A）。なお、この範囲における窒素利用可能性の変化は、酵母の増殖には影響を及ぼさなかった（表S7参照）。また、分泌されたアミノ酸は、いずれも生合成コストが最も低いものであることも観察された（図5B）。これらの知見はすべて、オーバーフロー代謝（過剰代謝）の存在を示唆しており、これはおそらく、過剰な窒素を「低コスト」なアミノ酸の形で排出するための手段として利用されているものと考えられる。

図5. 窒素の過剰排出によるニッチの創出と相利共生の成立

(A) 酵母によるアミノ酸の分泌量は、総窒素負荷量に比例する。総窒素含有量の異なる条件下での相対的な分泌量を示す。アミノ酸組成については表S7を参照のこと。

(B) 分泌されるアミノ酸は、生合成コストが最も低いものである。積み上げ棒グラフは、異なるコスト指標を表す：取り込み量のフラックスバランス変化に基づく無次元コスト（Barton et al., 2010、上段）、呼吸によるエネルギーコスト（Wagner, 2005、中段）、および前駆体の生合成を含む生合成のエネルギーコスト（Akashi and Gojobori, 2002、下段）。

(D) ラパマイシンおよびNCR/TORC1経路の変異に応答した、ブドウ果汁中での酵母によるアミノ酸の取り込み／分泌。挿入図：CDM35およびブドウ果汁における、異なる酵母株によるグルタミン分泌量。図S8およびS10も参照のこと。

(E) CDM35-ラクトース培地における酵母とL. lactis（ケフィア分離株）の相利共生的な増殖。OD600値は種培養（シードカルチャー）の値を示す。

(F) 酵母とL. lactis（ケフィア）との間の相利共生関係は、液体培養においても明らかである。挿入図は、単独培養および共培養における残留ラクトース量を示す。L. lactis（ケフィア）の細胞数はフローサイトメトリーにより測定した（STAR Methods）。

(G) CDM35-ラクトース培地における、酵母の単独培養およびL. lactis（ケフィア）との共培養でのアミノ酸濃度。

(A, C, D, F, G) のデータは、3回の独立した反復実験の平均値±標準偏差（SD）として示されている。

2.9.生態学的文脈における酵母と乳酸菌の共生

　次に、酵母と乳酸菌の間に見られる代謝的依存関係が、それらの自然生息環境においてどのような意義を持つのかを調査しました。私たちは、特定のワイン発酵過程などにおいてこれら2種が共存する自然培地であるブドウ果汁を用いて、S. cerevisiaeとL. plantarumの相互作用を検証しました。その結果、CDM35培地で観察された酵母と乳酸菌の相互作用は、ブドウ果汁においても同様に認められました（図5C）。オーバーフロー代謝が生じるために必要な「高窒素負荷」という条件と整合するように、天然のブドウ果汁中には、CDM35培地と同等の濃度で多くのアミノ酸が検出されました（表S8、図S8）。さらに、ラパマイシン処理や酵母のNCR（窒素異化代謝産物抑制）変異株がL. plantarumの増殖に及ぼす影響は、CDM35培地における条件と同様でした（図S10）。L. plantarumの増殖促進効果が最も高かったのはラパマイシン添加およびure2Δ変異株であり、次いでgtr1Δ変異株およびgln3Δ変異株が続きました。dal81Δ変異株に関しては、CDM35培地ではL. plantarumの増殖低下が観察されたものの、ブドウ果汁ではその影響が隠蔽されたと考えられます。これは、L. plantarumがCDM35培地では単独で増殖できないのに対し、ブドウ果汁中ではある程度単独で増殖できるためです。gln3Δ、dal81Δ、ure2Δ、およびgtr1Δ変異株によるグルタミン分泌や、ラパマイシン処理に応答したグルタミン分泌は、CDM35培地で示されたTORC1/NCR関連のメカニズムがブドウ果汁環境下でも機能していることを示唆しています（図5D）。さらに、ワイナリーやケフィアから分離された酵母株についても検証を行ったところ、いずれもL. lactisおよびL. plantarumの増殖を可能にしました。このことは、乳酸菌に有益な代謝産物の分泌能力が、酵母の間で広く保存されていることを示しています（図S11）。

　CDM35培地およびブドウ果汁のいずれにおいても、酵母と乳酸菌の間の代謝依存性は一方向性であるように見受けられ、酵母にとっての利点は、乳酸菌に依存することなく自身の代謝バランスを維持できる点にあります。我々は、酵母によるアミノ酸の分泌が、双方向的な栄養依存関係を確立する基盤となり得るのではないかと考えました。一部の発酵乳飲料において酵母と乳酸菌が共存していること（Prado et al., 2015; Tamang et al., 2016）を踏まえ、ケフィアから分離されたL. lactis株を用い、CDM35培地中のグルコースを牛乳の主要な糖であるラクトースに置き換えることで、この点について検討しました。我々は、L. lactis（ケフィア株）は従来通り窒素源を酵母に依存する一方で、酵母はラクトースを代謝できないため炭素源をL. lactis（ケフィア株）に依存するのではないかと仮説を立てました。実際に、CDM35-グルコース培地では予想通り一方向的な依存関係が見られたのに対し（図S12）、CDM35-ラクトース培地（固体および液体）では、酵母とL. lactis（ケフィア株）の間に相互依存関係が明確に認められました（図5Eおよび5F）。いずれの菌種の増殖およびラクトースの利用も共培養においてのみ観察され（図5F）、共培養の上清では、酵母の単独培養と比較して、CDM35-グルコース培地でも分泌されていたアミノ酸量が数倍に増加していました（図5G）。これらの結果は、単一の栄養素を変更するだけで、一方向的な代謝依存関係が相利的なクロスフィーディング（相互栄養供給）へと発展し得ることを示しています。

3.考察

　微生物群集における代謝産物交換の測定には困難が伴うため、これまでに報告されている相互作用の数は限られています。人工的な群集においてさえ、既知の相互作用は通常、交換される代謝産物が1〜2種類程度にとどまり、その多くは代謝産物の直接的な測定を伴わずに推定されたものです（Ponomarova and Patil, 2015）。本研究の成果は、栄養豊富な環境における複雑な多種代謝産物クロスフィーディング（代謝産物の相互供給）に関する知見を提供するものです。メタボロミクスと遺伝学の手法を組み合わせることで、酵母と乳酸菌の間で自然に成立した多種代謝産物クロスフィーディングの詳細と、その予想外の複雑さを明らかにすることができました。

　特定されたクロスフィーディング（代謝産物の相互利用）の相互作用は、群集代謝モデリングが実験データを補完する上で有用であることを示しています。シミュレーション結果全体としては不完全な点（セリンの交換が見落とされたことや、グルタミンとグルタミン酸が同等の値であると誤って予測されたことなど）がありましたが、窒素含有代謝産物の交換に関する予測自体は概ね正確であり、その結果に基づいて、非標的メタボロミクスで得られた候補の中から、標的型追跡解析の優先順位を決定することが可能になりました。本研究で得られたメタボロミクスデータは、個々の乳酸菌モデルおよび酵母・乳酸菌群集モデルの精度向上に役立つ可能性があります。

　本研究は、代謝的な相互作用の解明にとどまらず、酵母による代謝産物の分泌を促す制御プロセスに関する知見も提供するものです。我々の結果は、環境中に多様かつ豊富な窒素源が存在すると、栄養素の取り込みに不均衡が生じ（これは酵母にとって有害となり得るものです）、その結果、NCR（窒素異化代謝産物抑制）感受性経路を介して、酵母が過剰な窒素をアミノ酸として分泌するというモデルを示唆しています。そして、この分泌されたアミノ酸が、結果として乳酸菌の生育に寄与することになります。実際、酵母におけるアミノ酸の分泌（オーバーフロー）は、特定のアミノ酸（Velasco et al., 2004）やペプチド（Melnykov, 2016）の過剰な取り込みによって引き起こされる可能性があります。さらに、アミノ酸が添加されていない培地であっても、酵母は（量は比較的少ないものの）アミノ酸を分泌し得ることが示されています（Paczia et al., 2012）。特に他の栄養素が制限されている条件下では、窒素の過剰状態が酵母の増殖や細胞生存率に悪影響を及ぼすことが明らかになっています（Chen and Kaiser, 2002; Hess et al., 2006; Risinger et al., 2006; Tesniere et al., 2013）。したがって、アミノ酸などの窒素化合物が分泌されるのは、細胞内の過剰な、あるいは毒性を示し得るレベルの窒素を排除するための潜在的なメカニズムであると考えられます（Hess et al., 2006; Tesniere et al., 2013）。酵母はアミノ酸を自ら合成するよりも培地から取り込むことを好むため（Campbell et al., 2015）、培地中に多様なアミノ酸が存在すると、それらが汎用アミノ酸透過酵素（パーミアーゼ）による輸送をめぐって競合し、取り込みの不均衡が生じる可能性があります。汎用アミノ酸透過酵素Gap1pやTORC1が窒素毒性に関与していることは、我々のデータと整合するように、これまでの研究でも示されています（Chen and Kaiser, 2002; Risinger et al., 2006; Santos et al., 2012）。実際、我々の解析では、様々な変異株において、L. lactisの増殖と最も高い相関を示した輸送体はGAP1pの発現量でした（rho = 1, p = 0.017）。このことは、本研究で観察されたアミノ酸分泌が、制御された現象であることを裏付けるものでもあります。細胞の経済性の観点から解毒説を裏付けるものとして、過剰に産生・排出される（オーバーフロー）アミノ酸の生合成コスト（Akashi and Gojobori, 2002; Barton et al., 2010）が、いずれも最低水準にあることが観察されます。

　アミノ酸の「オーバーフロー（過剰放出）」には、豊富な窒素源の存在とNCR（窒素異化代謝抑制）制御下にある遺伝子の発現という、2つの要素が不可欠であることが明らかになりました。前者は「原料」を供給し、後者はそれを中心代謝へと組み込む役割を果たします。これら2つの因子の作用が組み合わさり、その強弱が変化することで、相互作用の表現型にグラデーションが生じます（図6A）。野生型酵母をCDM35培地で培養する場合、豊富なアミノ酸とNCR遺伝子の基礎的な発現という、これら両方の因子が揃った状態となります。これら2つの駆動力のいずれか（培地の栄養豊富さ、あるいはNCR機能）が低下すると、放出される栄養素の量は減少します。具体的には、窒素源を減らすことによる培地の栄養価低下や、DAL81またはGLN3のノックアウトによるNCR機能の低下がこれに当たります。対照的に、豊富な窒素源を維持したまま、ラパマイシン処理や転写因子Ure2pまたはGtr1pをコードする遺伝子の欠失によってNCR遺伝子の発現を亢進させると、代謝産物の放出量を増加させることができます。ブドウ果汁のような酵母の生育環境（ニッチ）にも豊富な窒素源が存在しますが、そこでもNCRに関連する窒素オーバーフローのメカニズムが働いており、乳酸菌に利益をもたらしていることを私たちは示しました。さらに、ある生物の代謝廃棄物が別の生物にとって生育を制限する必須栄養素となるような「窒素オーバーフロー」のプロセスは、相利共生へと進化する第一歩と捉えることができます。私たちは、環境中の栄養条件をわずかに変化させるだけで、酵母による窒素オーバーフローがいかにして乳酸菌（L. lactis）との相利共生関係の迅速な成立に寄与するかを示すことで、この点を実証しました。

図6.酵母によるニッチ形成は、代謝環境と細胞内制御機構の協調的な作用によって決定される

(A) 酵母と乳酸菌の相互作用に協調して必要とされる要因：培地中の多様かつ豊富な窒素源と、NCR（窒素異化代謝抑制）感受性遺伝子の活性。後者の活性は、ure2Δ、gtr1Δ株およびラパマイシン処理細胞では高く、gln3Δおよびdal81Δ株では低い。

(B) NCR制御下の代謝経路で多様な窒素源が処理された結果生じる代謝産物の溢出（オーバーフロー）。この溢出したアミノ酸が乳酸菌の生存を可能にする。一方、乳糖の代わりにグルコースが利用される場合には、L. lactis（乳酸菌）側からも同様の応答がなされる。

　本研究で示された窒素オーバーフローのメカニズム（図6B）は、酵母と乳酸菌からなる多様な群集において、栄養バランスやNCR（窒素異化代謝抑制）経路を利用することで、種動態を制御できる可能性を示唆しています。乳酸菌は栄養要求性が高い（偏食性のある）微生物です（Hayek and Ibrahim, 2013; Van Niel and Hahn-Hägerdal, 1999; Wegkamp et al., 2010; Zhang et al., 2009）。酵母にとっては極めて栄養豊富な環境であっても、乳酸菌の増殖を支えるには不十分な場合があります。しかし本研究で示したように、酵母の代謝産物は代謝ニッチを創出し、乳酸菌に対して持続的な生態学的影響を及ぼし得ます。ケフィアやキムチなどの多くの発酵食品において、酵母と乳酸菌の共生は有益なものとされていますが、一方で乳酸菌は、ワイン、ビール、バイオエタノール発酵における汚染菌としても知られています（Carvalho-Netto et al., 2015; Jespersen and Jakobsen, 1996; Vaughan et al., 2005）。野生株やブドウ果汁環境における酵母と乳酸菌の相互作用の重要性を実証したことは、自然環境下（in situ）での種間相互作用の制御に向けた大きな一歩となります。特に、窒素オーバーフロー代謝は、変動する自然環境下での栄養供給状況の変化に伴い、種間の共生関係を成立させるか、あるいは破綻させるかを左右する要因の一つであると考えられます。

　我々が構築した酵母と乳酸菌からなるこの群集は、真核生物と原核生物の間で、即座に成立し安定して維持される「クロスフィーディング（代謝産物の相互利用）」という共生関係を提示しています。この群集は、種間相互作用の創発や動態を研究するための、遺伝的・環境的に制御可能なモデルシステムとなるだけでなく、他の微生物群集における代謝的な結びつきを解明する上でも大きな可能性を秘めた実験系です。要約すれば、我々の研究成果は、代謝ニッチが形成される初期過程を分子レベルで明らかにし、ある種の生存がいかにして別の種の代謝特性によって支えられ得るかを示しています。

4.STAR★方法

4.1.主要リソース一覧表

4.2.試薬およびリソースの共有に関する連絡先

　詳細情報や試薬の提供依頼については、責任著者であるK. R. Patil博士（patil@embl.de）までご連絡ください。同氏が対応いたします。

4.3.実験モデルおよび供試株の詳細

4.3.1.菌株、培地、および培養条件

　Saccharomyces cerevisiae S90、Lactobacillus plantarum WCFS1、および Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403のプロトトロフ株を、それぞれYPAD、MRS、およびGM-17培地（5%グルコースを添加したM-17培地）を用いて前培養した。ケフィアから分離された酵母および乳酸菌の菌株は、S. Blasche博士（EMBL、ドイツ）より提供された。ワイン酵母株は、R. González博士（Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino、スペイン・ログローニョ）より提供された。

　化学的に組成が明確な培地（CDM35）は、既報の培地（Verduyn et al., 1992; Wegkamp et al., 2010; Zhang et al., 2009）を組み合わせて構成したリッチ培地の成分数を減らすことで設計された（表S1）。特記しない限り、ラパマイシン（Sigma-Aldrich社製）の濃度は20 nMとした。乳酸菌の培養液にラパマイシンを直接添加しても、その増殖には影響がなかった（図S13）。培地中の乳糖濃度は0.5%とした。有機ブドウ果汁は地元の店舗で購入し、共培養実験に使用する前にフィルター滅菌を行った。

　リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した前培養液を用い、OD600値0.01で液体培地での培養を開始した。すべての培養は30℃で静置条件下で行った。CDM35-ラクトース液体培地での培養は7日間行った。

　洗浄した乳酸菌培養液（OD600 = 0.1）および酵母培養液（OD600 = 0.2）をCDM35寒天培地（寒天濃度2%）に5 μLずつスポットし、固体培地での培養を開始した。乳酸菌の培養液は、酵母の接種箇所に近接させてスポットしたほか、対照として同一プレート上の離れた位置にもスポットした。30℃で2～3日間培養した後、プレートの画像を撮影した。なお、CDM35-ラクトース寒天培地については9日間培養を行った。

　CDM35培地における酵母ノックアウト株の増殖速度を測定するため、96ウェルマイクロタイタープレートを用いて静置培養を行い、BioTek Synergyマイクロプレートリーダーを使用して15分ごとにOD600を測定した。

4.3.2.酵母株の構築

　S90遺伝的背景において、4種類のノックアウト変異株（ure2Δ、gtr1Δ、dal81Δ、gln3Δ）を構築した。BY4741背景を持つ4種類の変異株（Mülleder et al., 2012）からゲノムDNAを抽出し、kanMX4カセットとそれに隣接する200～400塩基対のゲノム領域を含む断片を、既報のA-Dプライマー対（Winzeler et al., 1999）を用いてPCR増幅した。これらのPCR産物を用い、既報の方法（Gietz and Schiestl, 2007）を一部改変して、野生型S. cerevisiae S90株の形質転換を行った。対数増殖期中期（OD600 = 0.7、50 ml）の酵母培養液を遠心分離・洗浄し、1 mlの滅菌水に再懸濁した。次に、100 μlの細胞懸濁液に形質転換用混合液（50% w/v PEG 3500：240 μl、1.0 M 酢酸リチウム：36 μl、2 mg/ml 煮沸済み一本鎖キャリアDNA：50 μl、上述のPCR増幅産物：34 μl）を加え、再懸濁した。42℃のウォーターバスで40分間インキュベートした後、細胞をYPAD培地に再懸濁し、組み込まれた抗生物質耐性マーカーを発現させるために3～4時間インキュベートした。G418（300 μg/ml）を添加したYPAD培地を用いてクローンを選抜した。相同組換えの成功は、既報（Winzeler et al., 1999）に従い、A-D、A-KanB、およびC-KanDプライマー対（Table S6）を用いたコロニーPCRにより確認した。

4.3.3.馴化培地を用いたアッセイ

　酵母培養液（OD600 ≈ 1）を遠心分離し、その上清を0.2 μmのシリンジフィルターでろ過した後、乳酸菌種の24時間培養に使用した。TORC1関連遺伝子欠損を有する酵母株を検討するため、プロトトロフ性単一遺伝子ノックアウトライブラリー（Mülleder et al., 2012）から82株を選抜した。

4.4.手法の詳細

4.4.1.群集内の菌種の定量

4.4.1.1.コロニー形成単位（CFU）の計数

　共生培養の安定性試験では、3菌種のあらゆる組み合わせについて、24時間ごとに培養液20 μLを新鮮なCDM35培地2 mLに移植する継代操作を行った。CFUの計数は、3つの生物学的反復（biological replicates）のそれぞれについて3つの技術的反復（technical replicates）を行い、選択培地に塗布することで実施した。L. plantarumおよびL. lactisの菌数をそれぞれ選択的に測定するために、10 μg/mLのシクロヘキシミドを添加したMRS寒天培地およびGM-17寒天培地を使用し、酵母の選択には合成規定（SD）培地を使用した。使用したシクロヘキシミド濃度が乳酸菌に影響を及ぼさないことは確認済みである。計数に先立ち、プレートを30℃で2日間培養した。

4.4.2.種特異的qPCR

　種特異的プライマーを設計し（表S6）、当該群集内の他の種に対してその特異性を検証した。qPCR解析用の鋳型は、以下のように調製した。簡潔に述べると、1 mlの（共）培養液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを急速凍結して解析時まで保存した。凍結サンプルを1 mlの脱イオン水に再懸濁し、その混合液400 μlを、酸洗浄済みガラスビーズ（0.2～0.3 mm）0.5 mlが入ったポリプロピレン製スクリューキャップチューブに移した。ホモジナイズ処理は、FastPrep-24ビーズビーターを用いて行った（設定：4 m/s、2分間、氷上での間欠冷却を併用）。得られたライセートをアルカリ性PEG試薬（Chomczynski and Rymaszewski, 2006に記載の通り、60% PEG 200、20 mM水酸化カリウム、pH 13.3～13.5）で1000倍に希釈し、95℃で10分間インキュベートした。調製されたサンプル1 μlを、そのままqPCR反応に用いた。

　qPCR反応液は、鋳型1 μL、SYBR Green RT-PCRマスターミックス（Life Technologies）19 μL、およびプライマー（Sigma-Aldrich社にて合成・脱塩済み；終濃度0.5 μM）を用いて調製した。増幅はStepOne PlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用い、アニーリング温度60℃、40サイクルの条件で行った。定量は、既知の光学密度を有する対応する単一培養液の段階希釈系列を基準として行い、各マイクロタイタープレート上で標準曲線を作成した。データ解析にはStepOneソフトウェア（Applied Biosystems）を使用した。

4.4.3.フローサイトメトリー

　L. lactis（ケフィア由来）の（共）培養液0.5 mLを遠心分離して菌体ペレットを回収し、70%エタノールで洗浄した後、1 mM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁して、最終的な菌体濃度をOD600値で0.6に調整した。細菌のDNAを標識するための蛍光プローブとして、ヨウ化プロピジウム（PI、Sigma-Aldrich製）を用いた。PIをEDTA緩衝液中で最終濃度3 μg/mLになるように添加し、ボルテックスで混合した後、遮光下で10分間インキュベートした。続いて、各サンプルに対し、氷上での冷却を挟みながら、超音波処理（Branson Sonifier W-250 D、Heinemann製を使用；条件：4°C、振幅10%、10秒間［0.5秒のON/OFF間隔］の処理を5回）を行った。絶対菌体数は、CountBright™絶対計数用ビーズ（Thermo Fisher製）を10 μl添加することで測定した。PIおよび蛍光ビーズは、FACS BD Accuri™ C6サイトメーター（BD Biosciences製）を用い、低流速（low flow）設定でフローサイトメトリーにより同時解析した。PIおよびビーズのシグナルは、それぞれFL2およびFL4チャンネルで検出した。各サンプルにつき計10,000個のPI陽性細胞を解析対象とし、解析の閾値はFSC-Hを800、FL2-Hを600に設定した。混合培養サンプルの計数においては、サイズおよび蛍光特性に基づき、酵母細胞を解析対象から除外した。

4.4.4.酵母細胞の死滅および損傷の評価

　S90バックグラウンドを持つ5つの株（Δure2、Δgtr1、Δdal81、Δgln3、および野生型）について、死滅細胞および／または細胞膜が損傷した細胞の割合を評価するため、メーカーの指示に従い「LIVE/DEAD FungaLight Yeast Viability Kit」（Life Technologies社製）を使用した。対数増殖期の細胞を洗浄し、pH 7のTris緩衝生理食塩水に再懸濁して、OD600が0.4の細胞懸濁液を調製した。細胞をPIおよびSYTO® 9蛍光色素で染色し、LSR-Fortessaアナライザー（Becton Dickinson社製）を用いて計数した。蛍光シグナルは、SYTO9については励起／蛍光波長480／500 nm、PIについては490／635 nmで記録した。デブリや細胞の重なり（ダブレット）を除外するようにゲーティングを設定した。各サンプルについて、死滅／損傷細胞の数が少なくとも2000個に達するまで測定を行った。結果については、図S7BおよびS7Cを参照のこと。

4.4.5.非標的型エクソメタボローム解析

　酵母による培地の馴化中（馴化済み培地を回収する18時間時点まで）、およびL. lactisとL. plantarumの各培養における増殖中の複数時点で、上清サンプルを採取した。採取したサンプルは、0.2 μm PVDFシリンジフィルターおよび3 kDa MWCO遠心式フィルター（Millipore社製）に通してろ過した。10倍希釈したサンプルを、Gerstel MPS2オートサンプラー、日立L-7100 HPLCポンプ、およびAgilent 6550イオンファンネルQ-TOF質量分析計を組み合わせたプラットフォームを用いて分析した（分析条件はFuhrerら、2011年に準拠）。移動相には、5 mMフッ化アンモニウムでpH 9に調整したイソプロパノール：水（60:40, v/v）を用い、150 μL/minの流速でアイソクラティック溶出を行った。オンライン質量軸補正には、2-プロパノール（移動相に含まれるもの）、タウロコール酸、およびヘキサキス(1H, 1H, 3H-テトラフルオロプロポキシ)ホスファジンを使用した。質量スペクトルは、利用可能な最高分解能（4 GHz HiRes）を用い、50～1000 m/zの範囲で、1.4スペクトル/秒の頻度にてプロファイルモードで記録した。イオン源温度は325°Cに設定し、乾燥ガス流量は5 L/min、ネブライザー圧力は30 psiとした。フラグメンター、スキマー、およびオクトポールの電圧は、それぞれ175 V、65 V、750 Vに設定した。イオンの代謝物へのアノテーションは、KEGGデータベースを参照して0.005 Daの許容範囲内で行った。その際、[M-H]-および[M+F]-を主要イオンと見なし、H/K交換、H/Na交換、およびNaCl付加体を起こり得る中性付加（neutral gain）として考慮した。

4.4.6.RNA抽出、シーケンシング、およびデータ解析

　酵母培養液は、OD600が約1に達した時点で、同量の冷メタノールと混合し、-9℃で遠心分離を行うことで回収し、得られたペレットは-80℃で保存した。トータルRNAは、メーカーのプロトコルに従い、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出した。独自の工程として、qPCRの手順と同様のガラスビーズを用いたホモジナイズ処理や、Turbo DNAse（Invitrogen）を用いたカラム上でのDNA消化処理を行った。RNAの定量は、Qubit RNA Broad Range Assay Kitを用い、Qubit 2.0蛍光光度計（Invitrogen）で行った。cDNAライブラリは、トータルRNA 500 ngを出発材料とし、Beckman Biomek FXラボラトリーオートメーションワークステーションを用いて、Illumina社のRNA-Seqプロトコル（http://www.illumina.com/products/truseq_rna_sample_prep_kit_v2.ilmn）に従って調製した。調製したライブラリサンプルは、1レーンあたり12サンプルをマルチプレックスし、HiSeq2000（Illumina）プラットフォームを用いてシーケンシングを行い、50塩基長のシングルエンドリードを取得した。

　RNAシーケンシングリードの品質は、 FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を用いて評価した。FaQCs (Lo and Chain, 2014) を使用し、末端のトリミングおよび品質スコアが30以上かつ長さが30塩基対を超える断片のフィルタリングを行った。続いて、TopHat (Trapnell et al., 2009) を用いて、リードを S. cerevisiae S288c 参照ゲノム (R64-1-1) にマッピングした。HTSeq-count (Anders et al., 2015) により全遺伝子のリード数を抽出し、RパッケージであるDESeq2 (Anders and Huber, 2010) を用いて正規化した。その後の統計解析に向けて、平均リード数が10を超えるデータのみを抽出し、DESeq2の正則化対数変換（rlog）を適用した。

4.4.7.微生物群集におけるクロスフィーディングの代謝モデリング

　自動構築されたゲノムスケール代謝モデルおよび手動で精査された L. lactis IL1403 モデル（Oliveira et al., 2005）は、ModelSEED（Henry et al., 2010）データベースから入手した。L. plantarum および S. cerevisiae の手動精査済みモデルは、Teusink et al. (2006) および Zomorrodi and Maranas (2010) から入手した。L. lactis IL1403 の手動精査済みモデルについては、CDM35 培地での増殖能の欠如および既知の栄養要求性（表 S4）と、モデルによる in silico での増殖予測とを整合させるために更新を行った。具体的には、すべてののアミノ酸および 2-オキソグルタル酸の取り込み反応に加え、L. lactis MG1363 代謝モデル（Flahaut et al., 2013）と同様に、プロリンとリシンの生合成を可能にする2つの新規反応を追加した。さらに、L. lactis IL1403 はロイシン、アルギニン、バリン、グルタミン、グルタミン酸、およびイソロイシンを合成できないことが知られているため（表 S4）、これらの代謝物の生合成経路を遮断した。

　代謝物質のやり取りをシミュレートするため、個々の種のモデルを統合して群集モデルを構築しました。これにより、各種は代謝物質交換反応を介して、共通の外部代謝環境と相互作用できるようになります。その結果、構成するすべての種が、培地中の代謝物質や他の種によって分泌された代謝物質のプールを利用可能となりました。各種は、モデル内に交換反応（トランスポーターや自由拡散によるものなど）が存在する代謝物質についてのみ、分泌または取り込みを行うことができます。群集内における代謝物質の交換は、Zelezniakら（2015）によって導入されたSMETANAフレームワークを用いてシミュレートされました。具体的には、群集構成種のそれぞれの増殖を制約条件として設定し、一連の混合整数線形計画問題を解くことで、CDM35培地において起こり得るすべての代謝物質交換のパターンを網羅的に特定しました。なお、個々の種や群集全体において、増殖が最適であるという仮定は設けませんでした。

4.4.8.アミノ酸の定量（LC-MS）

　酵母の馴化培地を、0.2 μm PVDFシリンジフィルターおよび分画分子量（MWCO）3 kDaの遠心式フィルター（Millipore社製）に通してろ過し、10倍に希釈した後、その1 μLを用いてアミノ酸分析を行った。分析には、液体クロマトグラフィー（Agilent 1290 Infinity）およびタンデム質量分析（Agilent 6460）システムを用い、既報（Mülleder et al., 2016a）の手順に従った。本法では、タンパク質構成アミノ酸（システインを除く）、オルニチン、シトルリン、およびα-アミノ酪酸／γ-アミノ酪酸を対象とした。具体的には、Waters ACQUITY UPLC BEH Amideカラム（2.1 x 100 mm、1.7 μm）を用い、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）によるグラジエント溶出でアミノ酸を分離した。溶媒系には、いずれも0.176%ギ酸および10 mMギ酸アンモニウムを含む「アセトニトリル：水（50:50）」と「アセトニトリル：メタノール：水（95:5:5）」の2液を用いた。化合物の同定は、保持時間およびフラグメンテーションパターンを標準品（Sigma-Aldrich社製）と比較することによって行った。装置をSRM（Selected Reaction Monitoring）モードで稼働させて得られたシグナルは、Agilent MassHunterソフトウェアを用い、外部標準法による検量線に基づいて処理および定量を行った。

4.4.9.アミノ酸および乳糖の定量（GC-MS）

　CDM35-乳糖培地における酵母単独培養および酵母とL. lactisの共培養の培養上清を、0.2 μm PVDFシリンジフィルターおよび3 kDa MWCOフィルター（Millipore）でろ過した。内部標準としてリビトール（アドニトール）（Alfa Aesar, UK）を添加した。サンプル100 μLにメタノール（Biosolve Chimie, France）200 μLを加えて極性代謝産物を抽出し、72°Cで15分間インキュベートした後、MilliQ水200 μLを添加した。乾燥させた抽出物は、既報（Kanani et al., 2008）に従い、ピリジン（Alfa Aesar, UK）に溶解した20 mg/mLメトキシアミン塩酸塩（Alfa Aesar, UK）溶液100 μLと40°Cで90分間反応させ、続いてN-メチル-トリメチルシリル-トリフルオロアセトアミド（MSTFA）（Alfa Aesar, UK）200 μLと室温で12時間反応させることで、(MeOx)TMS誘導体へと誘導体化した。代謝産物の測定には、島津製作所製TQ8040トリプル四重極GC-MSシステムを用いた。ガスクロマトグラフには、30 m × 0.25 mm × 0.25 μmのDB-50MSキャピラリーカラム（Phenomenex, USA）を装着した。検出器は、m/z 50～600の範囲を記録するスキャンモードと、アミノ酸および乳糖をモニタリングするMRMモードの両方で動作させた。

4.4.10.アミノ酸およびポリアミンの検出（UPLC）

　酵母馴化培地中のアミノ酸およびポリアミンの定量は、メーカーのプロトコルに従い、AccQ-Tag™（Waters社）を用いた蛍光標識法により実施した。得られた誘導体は、Acquity H-class UPLCシステムに接続されたAcquity BEH C18カラム（150 mm × 2.1 mm、1.7 μm、Waters社）を用いて分離し、超高純度標準品（Sigma-Aldrich社）を用いて蛍光検出（Acquity FLR検出器、Waters社；励起波長：250 nm、蛍光波長：395 nm）により定量した。カラム温度は42℃に設定し、流速0.45 mL/minで、5カラム容量分のバッファーA（140 mM 酢酸ナトリウム pH 6.3、7 mM トリエタノールアミン）を用いて平衡化した。バッファーAに対するアセトニトリル（B）の濃度勾配は以下のように設定した：1分間 8% B、16分間 18% B、23分間 40% B、26.3分間 80% B（5分間保持）、その後3分間で8% Bに戻す。データの取得および解析は、Empower3ソフトウェアスイート（Waters社）を用いて行った。

4.4.11.分岐鎖α-ケト酸の測定

　分岐鎖α-ケト酸の含有量を分析するため、酵母の培養上清100 μLを、冷却した1 M過塩素酸200 μLと混合した。遠心分離により不溶物を除去し、得られた上清150 μLを同量の25 mM o-フェニレンジアミン溶液と混合した後、50℃で30分間インキュベートして誘導体化を行った。遠心分離後、誘導体化されたケト酸を、Acquity H-class UPLCシステムに接続したAcquity HSS T3カラム（100 mm × 2.1 mm、1.7 μm、Waters社製）を用いた逆相クロマトグラフィーにより分離した。分離に先立ち、カラムを40℃に加熱し、流速0.55 mL/minで溶媒A（10%アセトニトリル中0.1%ギ酸）をカラム容積の5倍量流して平衡化した。ケト酸誘導体の分離は、溶媒A中の溶媒B（アセトニトリル）の濃度を以下のように変化させることで行った：2分間はB 2%、5分でB 18%、5.2分でB 22%、9分でB 40%、9.1分でB 80%（2分間保持）、その後2分かけてB 2%に戻す。分離された誘導体は、蛍光検出（Acquity FLR検出器、Waters社製、励起波長：350 nm、蛍光波長：410 nm）により検出した。データの取得および処理は、Empower3ソフトウェアスイート（Waters社製）を用いて行った。

4.5.定量および統計解析

4.5.1.アミノ酸漏出量の推定

　パラメータ：細胞容積 = 45.54 fL、ODあたりの細胞数（1 mLあたり） = 3,200万個。細胞内アミノ酸濃度は (Mülleder et al., 2016b) の値を使用。アラニンの計算例：細胞内濃度は6 mM。死亡率0.04%（野生型細胞の平均値、図S7参照）におけるアラニンの推定放出量は3.5 × 10⁻⁶ mMであり、これはコンディションド・メディウム（培養上清）で観測された濃度の約20,000分の1に相当する。試験したすべての変異株の中で最も高い死亡率の推定値（0.22%）を用いた場合であっても、観測された濃度は、細胞溶解によって説明し得る濃度を数千倍上回っている。

4.5.2.統計解析

　異なる菌株や培地を用いて調製した馴化培地を比較する際、酵母培養液は同程度のOD600（約1）の時点で回収し、乳酸菌の増殖量は、対応する酵母培養液のOD600値を用いて正規化した。アミノ酸の定量に関しては、OD600が1.5を超えるサンプルを解析から除外した。スクリーニングは2つの技術的反復（テクニカルレプリケート）を用いて1回行い、乳酸菌の増殖に対して異なる影響を示した菌株については、少なくともさらに2回同様の実験を繰り返した。増殖速度（μ max）は、Rパッケージ「grofit」（Kahm et al., 2010）を用い、モデルに依存しない平滑化スプライン（model-free smoothed spline）を当てはめた際の最大傾きとして推定した。各条件間の比較におけるP値は、対応のない両側t検定を用いて算出した。実験に関する統計的な詳細は、図の凡例に記載されている。

　酵母が乳酸菌の増殖を促進する効果と正の相関を示す発現パターンを持つ遺伝子セットの特定を、以下の手順で行った。まず、各遺伝子について、酵母欠失株における発現量と、それに対応する酵母株の培養上清中で増殖した細菌の最終OD600値との間の相関係数（SpearmanおよびPearson）を算出した。これら両方の相関係数に基づいて遺伝子リストを順位付けし、Zスコアを生成・変換してp値を求めた。このp値を、Rパッケージ「piano」（Varemo et al., 2013）を用いた遺伝子セット濃縮統計量の算出における入力データとして使用した。解析には「Reporter」法を用い、p値は理論的な帰無分布（10,000回の順列置換に基づく）から算出した。得られたp値は、Benjamini-Hochberg法を用いて多重比較補正を行った。パスウェイ濃縮解析の対象とした遺伝子セット（各グループに少なくとも5つの遺伝子を含むもの）は、KEGGパスウェイ、Saccharomyces Genome Database (SGD) 由来の生化学的パスウェイ、Yeastractデータベース（Teixeira et al., 2014）に基づく転写因子DAL81およびGLN3の標的遺伝子（DNA結合および発現に関する証拠があるもの）、ならびにLjungdahlおよびDaignan-Fornier（2012）によって定義されたNCRパスウェイおよびアミノ酸トランスポーターの遺伝子セットで構成した。

参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください）

　この文献は、Cell Syst. 2017 Oct 25;5(4):345–357.e6.に掲載されたYeast Creates a Niche for Symbiotic Lactic Acid Bacteria through Nitrogen Overflow.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。

ケフィアライフをお勧めする中垣技術士事務所