アロニアジュースからの
HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の分離

Miyuki Kozuka, Takuya Yamane, Momoko Imai,

Satoshi Handa, Shigeo Takenakaf, Tatsuji Sakamoto, Tetsuo Ishida,

Hiroshi Inui, Yoshio Yamamoto,

Takenori Nakagaki, Yoshihisa Nakano

Food Bioscience 34 (2020) 100535

はじめに

アロニアベリーはポリフェノールを高濃度で含み（Jakobek、Šeruga、Medvidović-Kosanović、およびNovak、2007）、抗糖尿病（Yamane et al. 2016a）、抗高血圧症（Yamane et al. 2016b）、抗高脂血症（Valcheva-Kuzmanova et al. 2007）、抗高コレステロール血症（Duchnowicz、Nowicka、Koter-Michalak、& Broncel 2012）など人間の健康に有益な多くの機能を示します。 高コレステロール血症は、心臓血管疾患の主要な原因の1つであるアテローム性動脈硬化症を引き起こす可能性があります（Lu＆Daugherty. 2015）。アロニアベリーを摂取すると、血中の低密度リポタンパク質（LDL）-コレステロール濃度が低下する可能性があります（Ryszawa et al. 2006）。ただし、コレステロール低下効果のメカニズムは不明であります。
β-ヒドロキシ-β-メチルグルタリル-コエンザイムA（HMG-CoA）レダクターゼは、肝臓でのコレステロール合成の重要な酵素です（Nicolau、Shefer、Salen、& Mosbach、1974）。スタチンは、HMG-CoAレダクターゼの活性を阻害することにより高コレステロール血症を治療するために開発されました（Endo、1988）。多くの植物代謝産物も酵素の活性を阻害します。
　たとえば、アジア酸（Centella asiatica）（Ramachandran、サラバナン、およびSenthilraja 2014）、n-オクタデカニル-O-α-D-グルコピラノシル（6 ’→1”）-O-α-D-グルコピラノシド（Ficus virens bark）（Iqbal et al. 2015）、リコピン、クロロゲン酸およびナリンゲニン（トマトジュース）（Navarro-González、Pérez-Sánchez、Martín-Pozuelo、García-Alonso、& Periago、2014）、エピガロカテキン-3-ガレート（緑茶）（Cuccioloni et al. 2011）、およびイソラムネチンとピシジン酸（Opuntia ficus-indica）（Ressaissi et al. 2017）は、HMGCoAレダクターゼを阻害すると報告されています。したがって、アロニアジュースにHMG-CoAレダクターゼを阻害する二次代謝産物が含まれている可能性があります。
アロニアジュースからHMG-CoAレダクターゼの阻害剤を見つけるために、ジュースの代謝産物を逆相クロマトグラフィーを使用して分離し、酵素に対して有意な阻害活性を示す2つの画分を得ました。 液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（LC-ESI-MS / MS）およびMS3分析とこれら2つの画分の糖分析を行って、阻害剤の特性を明らかにしました。

結果

アロニアジュースからのHMG-CoAレダクターゼに対する阻害活性を有する化合物の分離
　図1に示すように、アロニアジュースはHMG-CoAレダクターゼ活性を約57％抑制しました。ジュースの分取逆相クロマトグラフィーにより、5つのフラクション（ワコーゲルフラクション1〜5）が得られました。5つのフラクションのうち、フラクション4は酵素を最も強く阻害しました（63％の阻害、図2）。ワコゲル画分4をHPLCにかけ、12の画分が得られました（図3A、InertSustain画分1〜12）。 InertSustainフラクション8および10は酵素を有意に阻害しました（図3C）。以下、明確にするために、フラクション8および10は、それぞれF1およびF2と呼ばれる。F1の吸収スペクトルは276、318、および494 nmに3つのピークがありましたが、F2の吸収スペクトルは278および494 nmに2つのピークがあり、約320 nmの肩がありました（図3D）。

阻害剤F2の質量分析による特性化は、LC-MSを使用して分析しました。
　 m / zが611.14のイオンのトータルイオンクロマトグラムと抽出クロマトグラムをそれぞれ図4AとBに示します。このイオンのMS / MSスペクトルは、316/99のm / zの強いイオンを示しました。294の質量の違いは、m / zが611.14のイオンから1つのヘキソース部分と1つのペントース部分が失われたことを示唆しています。m / zが317の陽イオンを生成できるアグリコンは2つ知られています。1つはイソラムネチンで、そのプロトン化イオン（[M + H] +）の計算質量は317.07です。もう一つはペチュニジンです。ペチュニジンはカチオン性で、計算された質量（M +）は317.05です。イソラムネチンは淡黄色の結晶を形成し（Wang et al。、2012）、その溶液はかすかに黄色を示します。F2溶液は強いワインレッド色を示したため（図3D）、F2がアグリコンとしてイソラムネチンを含む可能性は低いです。したがって、衝突誘起解離（CID）によって生成されたm / zが317のF2アグリコンイオン（図6C）から生成されたイオンの質量スペクトルは、ペチュニジン（図6D）からのそれと比較されました。 ペチュニジンで検出されたフラグメントイオンは、F2で得られた対応するスペクトルでも検出されました。
図5に示すように、F1はm / zが435の成分を含み、このイオンのCIDはm / zが303.00の強いフラグメントイオンを生成しました。132の質量の違いは、m / zが435のイオンからの1つのペントース部分の損失を示唆しています。F1溶液はF2溶液と非常によく似た強い赤ワイン色を示したため、観測されたフラグメントイオンはデルフィニジンである可能性が高く、計算された質量（M +）は303.05です。したがって、このF1コンポーネントのESI-MS / MS / MSスペクトルは、デルフィニジン-3-O-アラビノシドのスペクトルと比較されました（図7）。デルフィニジン-3-O-アラビノシドで検出されたフラグメントイオンは、F1コンポーネントで得られた対応するスペクトルでも検出されました。

インヒビターの糖組成
　 F1とF2に含まれる糖種を図8に示します。F2はグルコースとガラクトースを含んでいました。グルコースの量はガラクトースの量の約2倍でした。F1にはほぼ同じ量のグルコースとガラクトースが含まれていました。 ペントースに関しては、F1とF2の両方にアラビノースしか含まれていませんでした。

議論

　研究は、アロニアジュースがHMG-CoA還元酵素活性を阻害したことを示しました。  以前の研究では、アロニアジュースの投与により、ヒトとマウスの血中LDLコレステロール値が低下することが示されました（Xie et al、2017; Yamane et al、2016b）。これらの結果および本研究の結果は、アロニアジュースの化合物がHMG-CoAレダクターゼ活性の阻害を通じて高コレステロール血症を減少させることを示した。F2は、LC-MS分析で611の質量と317-Daポリフェノール部分を持つ単一イオンを示しました。 Tian et al（2017）によるベリー植物中のフェノール化合物の最近の包括的なプロファイリングは、アロニアベリーにイソラムネチン-ヘキソシド-ペントシドとイソラムネチン-ペントシド-ヘキソシドの存在を示しています。これらは、ESIを使用してm / zが611の[M + H] +イオンと、プロトン化されたフラグメントイオン317を生成できます。 しかし、図3Dに示すように、F2溶液は、イソラムネチンのかすかに黄色い色とは異なり、強いワインレッド色を示しました。さらに、ペチュニジンで検出されたフラグメントイオンは、F2のポリフェノールフラグメントでも検出されました（図6）。 糖組成分析では、F2にグルコースまたはガラクトースとアラビノースが含まれていることがわかりました（図8）。したがって、ジュースから精製されたHMG-CoAレダクターゼ阻害剤（F2、図3Aのピーク10）は、おそらくペチュニジン-グリコシド-アラビノシドですが、阻害剤の正確な化学構造はまだ決定されていません。

ペチュニジン配糖体は、マメ科（Pueraria lobata）（龍沢、谷川、中山、2017）とトマト（Solanum lycopersicum）（Ooe et al、2016）に含まれています。ペプチニジン配糖体を含む赤ブドウ果汁は、HepG2細胞のLDL受容体活性をアップレギュレートしました（Dávaloset al、2006）。 F1には多くの化合物が含まれており、それらのほとんどは特定できませんでした。しかし、1つの化合物（図5）は、デルフィニジンアラビノシドとして識別された可能性があります。デルフィニジン3-O-アラビノシドは、ブルーベリー（Vaccinium ashei）ワイン搾りかすに含まれています（He et al、2016）。

結論

アロニアジュースはHMG-CoAレダクターゼ活性を阻害し、画分のLC-ESI-MS / MS分析は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤としてペチュニジン-グリコシデアラビノシドおよびデルフィニジン-アラビノシドの存在を示しました。アロニアジュースのHMGCoAレダクターゼ阻害剤によるコレステロール低下効果のメカニズムは、肥満モデルを使用した研究から恩恵を受ける可能性があります。

この研究はFood Bioscience 34 (2020) 100535に掲載されたIsolation of HMG-CoA reductase inhibitors from aronia juiceを、一部を省略して日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原論文の全文を英文で読むことが出来ます。