Takuya Yamane, Momoko Imai, Satoshi Handa, Keiko Yamada, Tatsuji Sakamoto, Testuo Ishida, Hiroshi Inui, Yoshio Yamamoto,
Takenori Nakagaki, Yoshihisa Nakanoa

Journal of Functional Foods 58 (2019) 21–26

はじめに

アロニアベリー（Aronia melanocarpa）は、ロシアおよび東ヨーロッパ諸国の伝統医学で使用されています（Kokotkiewicz、Jaremicz、＆Luczkiewicz、2010）。アロニアベリーはフェノール性植物化学物質の含有量が高く、アロニアベリーの濃度はクランベリーの濃度よりも5倍以上高くなっています（Wu et al.、2004、2006）。2型糖尿病は多くの国で公衆衛生上の課題となっています（国際糖尿病連合、2017年）。DPP IV阻害剤、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）受容体アゴニスト、ナトリウムグルコース共輸送体2阻害剤などの血糖降下薬は、過去10年間に使用されています（Sterrett、Bragg、＆Weart、2016）。
糖化ヘモグロビン（HbA1c）の減少は、血糖コントロールと微小血管合併症の予防のための十分に検証された代理として認められています（European Medicines Agency、2012）。HbA1cレベルは、さまざまな糖尿病治療法に関する多くの試験で標準的な結果指標となっています（米国保健社会福祉省食品医薬品局、2008年）。アロニアベリーとその誘導体は、抗糖尿病効果があります。
動物モデル研究では、高血糖は、アロニアジュースを与えられた糖尿病ラットで軽減されました（Valcheva-Kuzmanova、Kuzmanov、Tancheva、およびBelcheva、2007）。アロニア抽出物を与えた動物では空腹時血糖値が低下しました（Qin＆Anderson、2012）。アロニアジュースを与えられたアロキサン誘発糖尿病のラットでは、血糖値が大幅に低下しました（Oprea、Manolescu、Fărcăşanu、Mladin、およびMihele、2014）。アロニアジュースを含む高脂肪食を与えられたラットでは、耐糖能が改善されました（Bhaswant、Shafie、Mathai、Mouatt、およびBrown、2017）。人間の介入研究において、空腹時血糖値は、インスリン非依存性糖尿病患者のアロニアジュースによって低下しました（Simeonov et al。、2002）。また、食事前にアロニアジュースを飲むと、精巣上体の血糖値も低下しました（Yamane et al.、2017）。
これらの研究は、アロニアが血糖値の低下と糖尿病の改善に非常に有用であることを示しましたが、メカニズムの大部分は解明されていません。 私たちの以前の研究では、アロニアジュースの成分の1つであるシアニジン3,5-ジグルコシドは、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP IV）活性を阻害します（Kozuka et al.、2015）。DPP IV（EC 3.4.14.5）はエキソペプチダーゼ（Ohkubo、Huang、Ochiai、Takagaki、およびKani、1994）であり、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）およびインスリン分泌性ペプチド（GIP）と同様にインクレチンを分解します。インクレチンは膵臓からのインスリン分泌を刺激して血糖値を低下させます（Baggio＆Drucker、2007; Kieffer、McIntosh、＆Pederson、1995; Mentlein、1999; Pridal et al。、1996）。したがって、DPP IV阻害剤により血糖値が低下します。 私たちの以前の研究は、アロニアジュースを与えられたKKAy糖尿病と肥満モデルマウスで血糖値と白い脂肪組織の重量が減少したことを示しました（Yamane et al。、2016）。しかし、生体内の糖尿病におけるシアニジン3,5-ジグルコシドの効果は明らかではない。この研究では、血糖値の低下に関する以前の研究でアロニアジュースに存在するDPP IV阻害剤として特定されたシアニジン3,5-ジグルコシドの効果を明らかにするために、シアニジン3,5-ジグルコシドをKKAyマウスに投与し、血糖値とHbA1cレベルと白い脂肪組織の重量を測定しました。さらに、2型糖尿病と肥満に対するシアニジン3,5-ジグルコシドの効果についても説明します。

2 材料と方法

2.1 材料

アロニアジュースは、中垣技術士事務所（大阪府）から提供されました。 シアニジン3,5-ジグルコシドおよびシアニジン3-Oグルコシドは、EXTRASYNTHESE（フランス、リヨン）から購入しました。シアニジン3-O-ガラクトシドとシアニジン3-O-アラビノシドはTOKIWA（千葉、日本）から購入しました。血糖値のHbA1cカートリッジとストリップは、SIEMENS（東京、日本）とNova Biomedical（マサチューセッツ、米国）からそれぞれ提供されました。 Gly-Pro-MCAおよびGLP-1 ELISAキットは、それぞれPeptide Institute（大阪、日本）およびIBL（群馬、日本）から購入しました。他のすべての化学薬品は分析グレードのものであり、和光純薬（大阪、日本）から購入しました。

KKAy雄マウスは、4週齢のCLEA Japan（東京、日本）から入手しました。 すべてのマウスに通常の食事を与えた（CE2食事、日本CLEA日本、東京、日本）。4日後、KKAyマウスを各グループ5匹のマウスの3つのグループに分けました：水を与えられたコントロールグループ、アロニアジュースを与えられたアロニアグループ、および10μg/ mLの溶液が与えられたcy-dgグループ 水で調製したシアニジン3,5-ジグルコシド（純度99.7％）。アロニアジュースとシアニジン3,5-ジグルコシド溶液は自由摂取で与えられました。食餌療法を開始してから49日後に、マウスをイソフルラン麻酔により犠牲にした。血清、肝臓、小腸、腎臓および脂肪組織を分離し、重量を測定した。

血糖値は、小型の血糖測定装置、Xpress 900（Nova Biomedical、マサチューセッツ、米国）を使用して測定されました。HbA1cレベルは、DCA Vantage Analyzer（SIEMENS、東京、日本）を使用して測定されました。

2.4 DPP IVアクティビティ

2.5 GLP-1とインスリンの酵素免疫測定法

GLP-1の血中濃度は、哺乳類のアクティブGLP-1測定キット（IBL、群馬、日本）を使用して測定されました。

肝臓のトリグリセリド含有量は、以前に記載されているように測定されました（Blige＆Dyer、1958）。簡単に言うと、肝臓組織（50 mg）を0.1 M酢酸で均質化し、1.8 mlのメタノール-クロロホルム（2：1、v / v）を加えました。遠心分離後、下層のクロロホルム層を回収し、残留物を0.5mlのクロロホルムで洗浄した。合わせたクロロホルム層を風乾した。 ペレットを10％Triton X-100を含む2-プロパノールに溶解した。トリグリセリド濃度は、和光トリグリセリドEテスト（和光、大阪、日本）を使用して測定しました。

アントシアニンの抽出は、Vieira et al（Vieira、Marques、Machado、Silva、およびHubinger、2017）によって記載された方法にいくつかの変更を加えて行われました。ワコーゲル50C18（富士フイルム和光ケミカルズ）1gを小さなガラスカラムに入れ、酢酸エチル、メタノール、水で順に洗浄した。この事前調整済みカラムに5 mLのアロニアジュースを入れ、カラムを約5 mlの水で、次に約10 mlの酢酸エチルで洗浄しました。結合したアントシアニンを、0.1％ギ酸を含む水中の90％メタノールで溶出しました。1.5 mlチューブに300μLのアリコートを含む画分を、遠心エバポレーターを使用して真空下でほぼ乾固するまで濃縮しました。チューブ内のサンプルを、HPLC分析に使用する平衡化溶媒300μLに再溶解しました（以下を参照）。

2.8 アントシアニンのHPLC分析

表1　アロニアジュースのアントシアニン含有量

2.9 統計分析

データは平均±標準誤差として表されます。統計分析は、一元配置分散分析とそれに続く対応のないスチューデントのt検定を使用して実行されました。 複数のサンプルの比較には、Tukey–Kramer検定を使用しました。

DPP IV活性は、シアニジン3-O-グルコシド、ケルセチン、シアニジンなどのいくつかのポリフェノールによって阻害されました（Yamane、2018）。 シアニジン3-O-グルコシドのDPP IV阻害活性は、シアニジンのそれよりも高かった（Kalhotra、Chittepu、Osorio-Revilla、およびGallardo-Velázquez、2018）。DPP IV活性は、シアニジン3-O-グルコシドよりもシアニジン3,5-ジグルコシドによって阻害された（Kozuka et al.、2015）。 一方、α-グルコシダーゼ活性はアロニア果汁を与えることによっても阻害され（Yamane et al.、2016）、アントシアニンなどのポリフェノールはα-グルコシダーゼ活性を阻害します（McDougall＆Stewart、2005）。これらのポリフェノールはアロニアジュースに含まれているため、シアニジン3,5-ジグルコシドとこれらのポリフェノールの組み合わせによるDPP IVおよびα-グルコシダーゼ活性の阻害により、アロニアジュースを与えることによる血糖値とHbA1cレベルの低下が発生する可能性があります。