Junhua Wu et al

Inflammation, Vol. 36, No. 4, August 2013

はじめに

　フィンランド発祥の半固体ヨーグルトであるヴィーリは、乳酸菌（LAB）とベルベットのような表面を形成する表面成長菌Geotrichum candidumの微生物作用に起因する、ロープ状のゼラチン状の一貫性と酸味を持っています。さらに、ヴィーリには酵母：Kluveromyces marxianusおよびPichia fermentansも含まれています。中温性LAB株の中で、スライム形成LAB cremoris は、リン酸塩含有細胞外多糖（EPS）を生成します。ヴィーリの EPSの基本構造は、主にDグルコース、D-ガラクトース、L-ラムノース、リン酸塩で構成され、平均分子量は約2,000 KDaで、繰り返し単位は「→4-β-Glcp-（1→4）- β-D-Galp（1→4）-β-D-Glcp-（1→”、および-L-Rhapと-DGalp- 1-pのグループ  Galp [1、2]の両側に取り付けられています。抗酸化、抗炎症、抗癌、抗老化、自然免疫の強化を含むさまざまな機能上の利点があると言われています[3-6]。
　マクロファージは自然免疫系の主要な構成要素を構成するだけでなく、急性炎症反応とアテローム性動脈硬化において極めて重要な役割を果たします[7]。
リポ多糖（LPS）刺激マクロファージは、一酸化窒素（NO）、プロスタグランジンE2、インターロイキン（IL）-1βおよび腫瘍壊死因子-a、マトリックスメタロプロテアーゼ-9 [8]などさまざまな炎症メディエーターを生成できますが、しかし、NOは最も重要な活性ガス分子であり、細胞内および細胞内シグナル伝達に重要です。一方で、免疫および炎症プロセスも仲介します。NOは、さまざまな生理学的および病理学的シグナル伝達の伝達に重要な役割を果たします[9、10]。したがって、NO産生は炎症過程を反映している可能性があり、炎症過程に対する薬物または機能性食品の効果を評価する手段を提供する可能性があります。 しかし、過剰なNOは有毒であり、これは有毒なONOO-分子をもたらすフリーラジカル基を形成する可能性があります[11、12]。
　この研究の目的は、食作用、NO、IL-6、IL-1βの放出、IL-6とIL-1βの遺伝子発現、誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）の遺伝子とタンパク質の発現を観察することと形態変化も同様に人間の免疫におけるVEPSの潜在的な可能な役割を調査するためにRAW264.7マクロファージ細胞におけるヴィーリエキソ多糖類（VEPS）の効果を調べることでした。

結果

VEPSはRAW264.7の細胞増殖を増加させました

　RAW264.7細胞に対するVEPSの細胞毒性効果を調べて、細胞増殖、NO放出、食作用、iNOS遺伝子発現、および細胞活性化の形態の分析のためのVEPS治療の適切な濃度範囲を確立しました。MTTアッセイにより、VEPSの濃度が50〜200μg/ mLの範囲内で、適切な濃度8 x 104 cell / mLで非細胞毒性が観察されました。VEPSはRAW264.7細胞増殖を有意に増加させ、LPSはRAW264.7マクロファージ細胞増殖を最大3倍刺激しました（図1）。 相乗効果も一緒に見られました（データは示していません）。 MTTの結果は、顕微鏡下での細胞数と一致していました。

図1. VEPSの異なる濃度での細胞増殖分析、LPSとコントロールの比較。
結果は平均値±標準偏差（n05）を表しています。 **対照群と比較して、p <0.01および* p <0.05。

VEPSはRAW264.7マクロファージ細胞の食作用を増加させました

RAW264.7の貪食活性は、中性フクシン（赤）取り込み法によって測定されました。VEPSの最終濃度が50から200μg/ mLに増加すると、OD値が増加し、VEPSがRAW264.7マクロファージの食作用を増加させることが示されました。 結果は平均±SD（n04）で表示されます（図2）。

図2. VEPSの影響を受けたRAW264.7細胞の食作用とLPSとコントロールの比較。
ニュートラルレッドによる食作用後の吸光度は570 nmで記録されました。 **対照群と比較してp <0.01。

RAW264.7細胞でのVEPS誘発NO産生

対照と比較したRAW264.7細胞のNO産生に対するVEPSの効果は、培地に放出された亜硝酸塩の量を測定することにより評価されました。NO産生がVEPSによって調節されたかどうかを調べるために、上清のグリースアッセイによってNO産生を定量化しました。NOは、刺激されていないRAW264.7細胞では非常に低かったが、VEPSでは適度に増加し（図3）、LPSでは大幅に増加した。

図3. VEPSの影響を受ける一酸化窒素（NO）と、グリース法を使用して測定されたLPSとコントロールの比較。
**対照群と比較して、p <0.01および* p <0.05。

VEPSはiNOSの遺伝子およびタンパク質発現を増加させました

ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンを差し引いたRT-PCRで示されるように、LPSとVEPSは明らかにiNOSを誘導しました。 iNOSの遺伝子発現はVEPSによって増加しました（図4）。
VEPSはまた、ウェスタンブロット法によって示されるiNOSのタンパク質発現を増加させました（図5）。

図4。LPSおよびVEPSを含むマクロファージRAW264.7細胞におけるRT-PCRによるiNOSの遺伝子発現。
A　MMWmarker; コントロール、LPS、およびVEPSのレーン1〜5は、それぞれ異なる濃度で示されています。
B　ハウスキーピング遺伝子β-アクチンを収縮させた後、相対光学密度（ROD）をプロットしました。

**対照群と比較してp <0.05。

図5. VEPSの濃度が異なるマクロファージRAW264.7細胞でのウエスタンブロットによるiNOSのタンパク質発現。
A　ウェスタンブロット：異なる濃度のコントロール、LPS、およびVEPSのレーン1〜5がそれぞれ示されています。
B　ハウスキーピングβ-アクチンタンパク質を収縮させた後、RODによってプロットされた発現値。

**対照群と比較して、p <0.01および* p <0.05。

VEPSはIL-6およびIL-1βの分泌と遺伝子発現を増加させました

ELISA法により検出された分泌インターロイキン、IL-6およびIL-1βは、LPSよりも弱いにもかかわらず、VEPSがIL-6およびIL-1βを増加させたことを示しています（図6）。
IL-6（図7a）およびIL-1β（図7b）の遺伝子発現は、コントロール（図7c）と比較して有意に増加しました。

図6。50、100、および200μg/ mLのVEPSで刺激した後のRAW264.7細胞のIL-6およびIL-1βの分泌、LPSと対照の比較、

** p <0.01および* p <0.05 コントロールグループ。

図7.マクロファージRAW264.7のインターロイキン遺伝子発現は、RT-PCRによりVEPSおよびLPSに影響を受けました。
 a IL-6、b　IL-1β、c　ハウスキーピング遺伝子β-アクチンを収縮させた後、RODによってプロットされた発現値。
 M　分子量、対照のレーン1〜5、LPS、および異なる濃度のVEPSがそれぞれ示されています。

**対照群と比較した有意性については、p <0.01、* p <0.05。

VEPSによるRAW264.7の形態変化

マクロファージは通常、SEM観察下のコントロールと比較して、LPSおよびVEPSでの刺激後に平坦化されました（図8）。これは、細胞骨格がより速い増殖中に影響を受けたという事実によるものです。マクロファージは、LPSで表面全体に細胞質突起が広がる扁平な外観を採用し、VEPSは相乗的に典型的な活性化状態を示しました。 濃度が高くなると、コントロール（図8a）と比較して、マクロファージはより長く平らになりました（図8b–h）。 形態変化と組み合わせて、VEPSがLPSと非常に似た機能を持っているが、より穏やかな方法であることは明らかです。

図8。SEMによるVEPSおよびLPSの刺激下でのRAW264.7の細胞形態。
aコントロール、b LPS 1μg/ mL、VEPS 50、100、および200μg/ mLをそれぞれ含む

c–e。元の倍率は4,000倍で、SEMの元のスケールは各画像で10μmを表します。

Lactococcus lactis subsp cremorisのVEPSは、2つのブタ腸管受容体（poRP105およびpoMD-1 [20、21]）を介してNF-κBおよびさまざまなサイトカインを強く誘導することができました。これは、ヒトに非常に近いモデルであるマウスマクロファージRAW264.7細胞の調査に影響を与えました。マクロファージは通常、小腸に蓄積され、さまざまな化合物によって引き起こされる感染に対する宿主防御として、自然免疫および適応免疫において重要な役割を果たします。 非常に頻繁に、多糖類またはLPSが関与します。
私たちのアッセイでは、VEPSは50、100、および200μg/ mLの濃度でRAW264.7の細胞増殖を増加させる能力、また、食細胞NO分泌、iNOS遺伝子およびタンパク質の発現、分泌の著しい増加、私たちのアッセイでは、VEPSは50、100、および200μg/ mLの濃度でRAW264.7の細胞増殖、また、食細胞の著しい増加、NO分泌、iNOS遺伝子およびタンパク質の発現、分泌、IL-6およびIL-1βの遺伝子発現を増加させる能力を示しました。そして平坦化形態を示しました。陽性対照では、LPSはVEPSグループと比較してはるかに強力であることを常に示しています。 LPSの存在下でVEPSを使用した場合にも相乗効果が観察されました（データは示していません）。NOは、炎症反応のメディエーターおよびレギュレーターとして認識されています。亜酸化窒素シンターゼには3つのアイソフォームがあるが、iNOSはNO合成で最も重要な重要な酵素であり、多くの生理学的および病理学的機能に直接影響します。
たとえば、T細胞と抗原提示細胞の結合体による抗原認識の瞬間、または生体内の特定のホルモンの存在下で、炎症のイベントでサイトカインの放出を促進する[22–25]心血管を弛緩させ、血流を増加ささせます。VEPSによるNO産生と遺伝子発現の増強は用量依存的であり、これはVEPSが免疫メディエーター/モジュレーターであることを強く示唆しています。
VEPSとLPSの両方を適用すると、NOの分泌が大幅に増加しました。これは、半定量的RT-PCRによるiNOSの並行増加もあり、VEPSもタンパク質のiNOS発現を増加させたため、ウエスタンブロッティング分析によって両方に同様のメカニズムがある可能性を示しています。
NOは、非特異的炎症メディエーターであり、通常、マクロファージの増殖のトリガー、および特異的および非特異的免疫のBおよびTリンパ球の誘発に関与し、in vivoで中枢神経系および他の免疫調節も刺激します。

腸のマクロファージは、粒子の飲み込みと摂取を処理してファゴソーム（または食物液胞）を形成し、それがリソソームと融合してファゴリソソームを形成するのが一般的です。
飲み込まれた物質は最終的に消化または分解され、エキソサイトーシスを介して細胞外に放出されるか、細胞内で放出されてさらに処理されます。

マクロファージの細胞形態は、LPSによって活性化されると、丸い形状から平らな形状または広がった形状に変更できることが報告されています[28]。 ただし、RAW264.7の同様の形態がVEPSによって平坦化されたのは今のことです。平坦化と広がりの形状の程度は、増殖、食作用、NO放出およびiNOS発現と一致しています。形態学的変化のプロセスは、細胞骨格アクチンの複雑で動的な再編成に関与しています[29]。しかし、VEPSによるこれらの活性化は、さらに研究する必要があるにもかかわらず、マクロファージの細胞増殖を有利に増加させ、免疫を促進する可逆的な生理学的プロセスであると考えています。