Mobin Malik et al., |
要約 |
理論的根拠: 腸内微生物叢とアテローム性動脈硬化症の間には強い関連性が明らかになってきています。 我々の最近のデータは、L. plantarum 299v (Lp299v) の補給により雄ラットの梗塞サイズが減少することを示唆しています。 L. plantarum 299v の血管系への影響に関して入手できるヒトのデータは限られています。 |
目的： 安定した冠動脈疾患（CAD）を患うヒトにおいて、経口L. plantarum 99v補給が血管内皮機能を改善し、全身性炎症を軽減するかどうかを判定する。 |
方法と結果: 冠動脈疾患が安定している20人の男性が、L. plantarum 299v（200億CFU）を含む飲料を1日1回、6週間にわたって摂取した。 4週間の休薬後、被験者には経口液体バンコマイシンの10日間の研究（250mgを1日4回）にさらに参加する選択肢が与えられた。 血管内皮機能は、上腕動脈血流媒介拡張（FMD）によって測定されました。 L. plantarum 299v の前後で、血漿短鎖脂肪酸、トリメチルアミンオキシド (TMAO)、およびアディポカインのレベルを測定しました。 追加の血漿サンプルは、液体クロマトグラフィー/質量分析 (UHPLC/MS) を使用して不偏メタボローム分析を受けました。 16S rDNA シーケンスを使用して、便マイクロバイオームの変化を決定しました。 冠動脈疾患患者から細動脈を入手し、L. plantarum 299v研究対象からの血漿と管腔内でインキュベートした後、内皮依存性血管拡張をビデオ顕微鏡で測定した。 L. plantarum 299vの補給は、血漿コレステロールプロファイル、空腹時血糖値、またはBMIに大きな変化をもたらすことなく、上腕動脈血流媒介拡張（FMD）を改善しました（P=0.008）。 バンコマイシンは上腕動脈血流媒介拡張（FMD）に影響を与えませんでした。 L. plantarum 99v の補給は、IL-8 (P=0.01)、IL-12 (P=0.02)、およびレプチン (P=0.0007) の循環レベルを低下させましたが、血漿トリメチルアミンオキシド (TMAO)濃度は有意に変化しませんでした (P=0.27)。 血漿プロピオン酸塩 (P=0.004) は増加しましたが、酢酸塩レベルは減少しました (P=0.03)。 L. plantarum 299v 後の血漿は、冠動脈疾患患者の抵抗性動脈における内皮依存性の血管拡張を改善しました (P=0.02)。 16S rRNA 分析により、プロバイオティクス後の便サンプルではLactobacillus属が他の変化なしに濃縮されていることが示されました。 |
結論: L. plantarum 299v は、従来の危険因子やトリメチルアミンオキシド (TMAO)の変化とは無関係に、冠動脈疾患患者の血管内皮機能を改善し、全身性炎症を軽減しました。 循環する腸由来の代謝産物がこれらの改善の原因である可能性が高く、さらなる研究に値します。 |
| 目次（クリックして記事にアクセスできます） |
| 2.方法 |
| 2.1.研究対象 |
| 2.2.治療の割り当て |
| 2.3.プロバイオティクス介入のための訪問手順を研究します |
| 2.4.オプションのバンコマイシン介入研究 |
| 2.5.上腕動脈反応性による生体内内皮機能の測定 |
| 2.6.便マイクロバイオーム分析 |
| 2.7..血漿トリメチルアミンオキシド (TMAO)、アディポカイン、サイトカイン、および循環接着分子の測定 |
| 2.8.循環短鎖脂肪酸の測定 |
| 2.9.非標的メタボロミクスプロファイリング |
| 2.10.ビデオ顕微鏡による生体外ヒト細動脈内皮依存性血管拡張の評価 |
| 2.11.統計分析 |
| 3.結果 |
| 3.1.被験者募集 |
| 3.2.介入グループ別のベースラインの特性と変化 |
| 3.3.全体的な血漿代謝物含有量に対するL. plantarum 299v 補給の影響 |
| 3.4.ヒト微小血管の内皮依存性血管拡張に対するL. plantarum 99v補給後の血漿およびトリメチルアミンオキシド (TMAO)の影響 |
| 3.5.血漿バイオマーカー |
| 3.6.マイクロバイオームプロファイリング |
| 3.7.プロバイオティクス治療前と後のサンプル間の一対の比較 |
| 4.議論 |
| 本文 |
| 1.はじめに |
| 従来の心臓危険因子の治療によってある程度の進歩は見られましたが、アテローム性動脈硬化性疾患は依然として先進国における罹患率と死亡率の主な原因であり、発展途上国では問題が増大しています。 したがって、心血管疾患の進行を予防および治療するための新規治療法を特定するという、満たされていない臨床上の大きなニーズが存在します。 このような潜在的な治療法の開発には、メカニズムに基づいた介入を開発できるように、心血管疾患に寄与する追加の寄与プロセスを特定する必要があります。 |
| 人間の腸管には、生命の 3 つの領域すべてを代表する何兆もの微生物が定着しています。 腸内微生物叢からのシグナルは、正常な発達と生理機能にとって重要です。 患者または動物モデルにおけるこれらの微生物群集の変化（腸内細菌叢異常）は、複数の疾患状態に関連しています。 最近のヒトおよびヒト組織ベースの関連研究では、腸内マイクロバイオームとアテローム性動脈硬化症の有病率との間に強い関連性があることが示唆されています （1、2）。 ヒトの腸内マイクロバイオームの種のバランスと多様性の違い（Firmicutes門とBacteroides門の蔓延率）は、アテローム性動脈硬化症の発症とプラークの安定性に関連しています（3）。 食事によるコリン摂取は、腸内微生物叢によるコリンのトリメチルアミンへの代謝に由来する循環トリメチルアミンオキシド（TMAO）の増加を通じて、アテローム性動脈硬化性プラークの形成と機構的に関連していると考えられています（4-7）。 抗生物質、糞便移植、高繊維食、酢酸補給を使用したマウスベースの原理実証研究は、腸内細菌叢が血管機能とアテローム発生の一因となる全身性炎症の調節に重要な役割を果たしているという概念を裏付けています（5、8-10）。 |
| しかし、現在までのところ、腸内マイクロバイオームを標的とした介入が有害な心血管イベントのリスクが高い個人の血管内皮機能を改善するかどうかを検討するヒトのデータは限られている。 内皮機能障害はアテローム性動脈硬化症が発症する前に始まり、アテローム性動脈硬化性疾患が蔓延している人でもそうでない人でも、将来の有害な心血管イベントを予測します（11-15）。 内皮機能不全の重要な要素には、非侵襲的手段で容易に測定できる一酸化窒素の生物学的利用能の障害、および全身性および内皮の炎症表現型の存在が含まれます（15）。 Lactobacillus plantarumの補給は、健康な喫煙者の循環レプチンレベル、収縮期血圧、およびフィブリノーゲンレベルを低下させます16。 我々は最近、L. plantarum 299v (Lp299v) の補給またはバンコマイシンの投与により、高血圧の雄ラットの心筋梗塞サイズが減少することを実証しました（17）。 さらに、L. plantarum は、アテローム性動脈硬化症のマウス モデルにおいて、リポポリサッカライド（LPS ）を介したアテローム性動脈硬化性プラークの炎症を軽減します（18）。 これらのデータは、L. plantarum 299v がヒトの血管の健康に有益な効果をもたらす可能性があるという概念を裏付けていますが、マウスモデルからの発見を翻訳し、ヒトにおける考えられる効果のメカニズムの決定を開始するには、さらなるヒトでの研究が必要です。 |
| 私たちは、L. plantarum 299v の補給により、冠動脈疾患患者の内皮機能が改善され、全身性炎症が軽減されるのではないかと仮説を立てました。 私たちは、安定した冠動脈疾患を患う21人の男性を対象に、毎日L.plantarum 299vを6週間摂取するパイロット研究でこの仮説を検証しました。 in vivo の内皮機能や全身性炎症マーカーの直接測定に加えて、 われわれは、L. plantarum 299v補給のヒト血管内皮およびヒト単核細胞に対する好ましい効果が循環血漿組成の変化によるものであるかどうかを直接試験するために、補給前後にこれらの被験者から得られた血漿を使用した。 |
| 2.方法 |
| この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 |
| 2.1.研究対象 |
| 2013年から2015年の間に、冠動脈造影検査によって診断された安定した冠動脈疾患を持つ21人の男性（40歳から75歳）が募集された（ClinicalTrials.gov識別子：NCT01952834）。 参加者は、投稿および配布されたチラシ、印刷メディア広告、インターネットベースの広告、および医師の紹介によってミルウォーキー都市圏から募集されました。 研究プロトコールはウィスコンシン医科大学の治験研究委員会によって承認され、すべての参加者は研究参加前に書面によるインフォームドコンセントを提出しました。 |
| 登録前のスクリーニングには、現在の投薬を含む詳細な病歴と、隠れた非心臓疾患をスクリーニングし、研究参加の適格性を評価するための研究医師による心臓および血管の焦点を絞った身体検査が含まれます。 参加者は、年齢が40～75歳、男性で、既知の冠動脈疾患の病歴（心筋梗塞の病歴、少なくとも1つの主要な心外膜冠動脈における50％以上の狭窄を示す血管造影、または、血管造影検査では偽陽性検査であることが判明していなかった虚血の証拠を示した以前の負荷検査）を有する場合に研究の参加資格が得られた。 プロバイオティクスの補給とバンコマイシンの利点を実証したこれまでの動物研究が雄のラットのみで実施されたことを考慮すると、この研究には男性のみが含まれた。 以下の基準のいずれかを満たす個人は参加から除外された：登録後 1 か月以内の病歴、ECG、または酵素基準による不安定狭心症または心筋梗塞。 心エコー図、MRI、または核画像による登録後1年以内の左心室駆出率（LVEF％）が45％未満として定義される左心室機能不全。 コントロールされていない安静時高血圧（血圧が170/100 mm Hgを超える）。 慢性腎不全（クレアチニンクリアランス < 60 mL/min）。 慢性肝疾患。 登録後5年以内に化学療法が必要ながん。 認識機能障害; 植込み型除細動器または永久ペースメーカー。 スクリーニング来院から12週間以内にプロバイオティクス、プレバイオティクス、または抗生物質の投与を受けた。 登録前6週間におけるHMG-CoAレダクターゼ阻害剤を含む血管作動薬の用量変更。 |
| 2.2.治療の割り当て |
| 適格な被験者は、200億個のコロニー形成単位の細菌を含む市販のLactobacillus plantarum 299v製剤（NextFoods、コロラド州ボールダー）であるGoodBelly StraightShotを1日あたり2.7オンス摂取する6週間のサプリメントに非ランダムに割り当てられた。 グッドベリー ストレートショット 1 回分には 50 カロリーと 13 グラムの砂糖が含まれています。 さらに、プロバイオティクスの介入を完了した個人には、Lactobacillus plantarum 299vによる6週間の治療の約1か月後に始まる、経口液体バンコマイシン投与の10日間の研究に追加で参加するオプションがありました。 |
| 2.3.プロバイオティクス介入のための訪問手順を研究します |
| 電話によるスクリーニングに合格したすべての被験者は、研究適格性を確認するためのスクリーニング訪問に招待されました。 患者は研究訪問前に一晩絶食した。 血圧と心拍数を 3 回測定し、平均した。 人体計測 (身長、体重、腹囲) はメートル単位で測定されました。 末梢静脈血は、心血管疾患の従来の危険因子（総コレステロール、LDL コレステロール、トリグリセリド、血清グルコース、ヘモグロビンA1C）を含むバイオマーカー分析のために上肢静脈から採取されました。 炎症性サイトカイン ; 循環アディポカイン。 そしてメタボローム解析。 バイオマーカーは、ベースラインおよびプロバイオティクス介入段階の終了時にのみ測定されました。 マイクロバイオーム分析のために、プロバイオティクス療法の前後で便サンプルを収集しました。 上腕動脈反応性によって測定される内皮機能は、ベースライン時とプロバイオティクス介入の終了時に、我々の研究室の標準手順を使用して測定されました。 |
| 2.4.オプションのバンコマイシン介入研究 |
| 研究のプロバイオティクス段階の完了後、参加者には、30日間の休薬期間後に開始される10日間の経口バンコマイシン研究に登録する選択肢が与えられた。 バンコマイシンは 250mg の用量で調剤され、介入期間中 1 日 4 回摂取されました。 上腕反応性による内皮機能の測定は、10日間のバンコマイシン投与の前後に行われました。 |
| 2.5上腕動脈反応性による生体内内皮機能の測定 |
| 私たちの研究室で以前に実施されたように、利き腕の上腕動脈の内皮機能の in vivo 測定には、血管超音波を使用した標準的で検証された技術が使用されました（19-22）。詳細については、オンライン サプリメントに記載されています。 |
| 2.6.便マイクロバイオーム分析 |
| Lactobacillus plantarum摂取の直前および摂取後42日目に、20人の被験者のうち17人から便を採取した。 細菌 DNA は便サンプルから単離され、濃度は 34 ng/μl ～ 154 ng/μl、総質量は 500 ng ～ 2300 ng で、－20℃ で保存されました。 細菌の 16S rRNA 遺伝子は、縮重フォワード プライマー: 5'-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3' および非縮退リバース プライマー:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' を使用して増幅されました。 細菌の 16S rRNA 遺伝子 PCR 増幅を 35 サイクル実行しました。 サンプルは仕様に合わせて増幅され、ハイブリダイゼーションに進みました。 各サンプルについて、PCR 産物を精製するための固相可逆固定化法を使用して増幅産物を濃縮し、Agilent 2100 Bioanalyzer を使用した電気泳動によって定量しました。 |
| ヒト糞便 DNA サンプルの細菌の多様性と比較群集構造は、Second Genome Inc. (カリフォルニア州サンフランシスコ) によって、高密度 G3 PhyloChip 16S rRNA マイクロアレイ ベースのアッセイとバイオインフォマティクス手法を使用して特性評価されました。 微生物叢の分析は、サンプル間の距離を計算し、微生物叢の非類似性の重要性を評価することに焦点を当てました（23）。 データ分析には、前処理とデータ削減、要約、必要に応じて正規化、サンプル間の距離メトリクス、順序付け/クラスタリング、サンプル分類、有意性テストなど、いくつかの個別の段階が組み込まれています。 マイクロアレイ分析とデータ分析の詳細は、オンライン サプリメントに含まれています。 |
| 2.7.血漿 トリメチルアミンオキシド（TMAO）、アディポカイン、サイトカイン、および循環接着分子の測定 |
| ヒト血漿サンプル中のトリメチルアミンオキシド（TMAO）の分析は、Wang et al. 2014.から引用されました（24）。 これらのバイオマーカーのすべてのアッセイに関する詳細は、オンライン サプリメントに含まれています。 |
| 2.8環短鎖脂肪酸の測定 |
| プロバイオティクス補給前後の血漿サンプル中の短鎖脂肪酸の測定は、必要に応じて 13C または 15N 同位体標識参照化合物を活用した標的質量分析アプローチを使用して、メイヨー クリニック メタボロミクス研究コア (U24DK100469) によって実施されました。 |
| 2.9.非標的メタボロミクスプロファイリング |
| 非標的代謝物プロファイリングは、Agilent 1290 Infinity UHPLC システムと組み合わせた 6550i Funnel Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer を使用して、Mayo Clinic Metabolomics Research Core (U24DK100469) によってプロバイオティクス補給前および補給後のペアの血漿サンプルに対して実行されました ( 米国アジレント社）。 代謝物の分離は、親水性相互作用カラムと非極性逆相 C18 カラムを使用して達成されました。 各実行中に、サンプルのサブセットで構成される品質管理サンプルが注入されました。 推定代謝物の同定は、Metlin データベースと MetaCore を使用し、±10 ppm の検出ウィンドウで実行されました。 サンプルの 80% 以上に存在する代謝物のみが報告され、分析に使用されました。 この分析に適した前後の血漿サンプルは、研究を完了した被験者 20 人中 18 人から入手できました。 |
| 2.10.ビデオ顕微鏡による生体外ヒト細動脈内皮依存性血管拡張の評価 |
| 臀部脂肪体生検または外科的廃棄物から採取したヒトの小抵抗性細動脈を調製し、アセチルコリン (Ach) の用量を増加させたときの内皮依存性血管拡張を、前述のようにビデオ顕微鏡で測定しました （21, 25-27）。 血管の直径は、Ach を添加するたびに、デジタル ノギス (Boeckeler Instruments、ツーソン、アリゾナ州) を使用したビデオ顕微鏡法によって測定しました。 各組織サンプルからの対の血管を、血管運動測定前の6時間、Lp299v補給の前後で得られた血漿に管腔内曝露した。 管腔内 L-NAME (100 μmol/L) への曝露を 30 分間行った後、各種類の血漿中でインキュベートしました。 血管研究の各シリーズの最後に、パパベリン (0.2 mmol/L) を添加することによって平滑筋の反応性を測定しました。 健康なボランティアからの追加の血管の内皮依存性血管拡張を、10 μM トリメチルアミンオキシド（TMAO）への 4 時間の曝露の前後で測定しました。 このトリメチルアミンオキシド（TMAO）濃度は、心血管イベントを繰り返すリスクが最も高い 冠動脈疾患患者の血漿中で報告されている濃度の約 2 倍に相当するため、選択されました（28）。 |
| 2.11.統計分析 |
| 統計分析は、SPSS 22.0、SigmaPlot 12.5、および GraphPad Prism を使用して実行されました。 被験者の特徴、血漿バイオマーカー、および内皮機能の測定値は、ベースライン時および6週間のプロバイオティクス補給後に測定され、必要に応じて非正規分布データに対する対応のあるt検定またはウィルコクソン符号付き順位検定によって比較されました。 繰り返し測定を伴う一般的な線形モデルを使用して、チエノピリジンまたはベータ遮断薬の使用が Lp299v の影響を大幅に変更するかどうかを決定しました。 他の薬物クラスは、研究対象集団での使用率が高いか低いため、このような分析から得られる洞察が限られているため、この方法ではテストされませんでした。 別のバンコマイシンのサブ研究では、バンコマイシン治療の前後で対応のある t 検定によって同様の測定値も比較されました。 この研究の主要結果は上腕動脈の血流媒介拡張（FMD%でした。 我々のアドホック検出力分析は、アルファ=0.05で20%の脱落率を仮定すると、22人の被験者の登録により、ベースラインからの血流媒介拡張%の25%増加を検出する80%の検出力を与えることを示唆した。 <0.05 の P 値は、ターゲットを絞っていないメタボロミクス解析を除くすべての比較で統計的に有意であるとみなされました。 非ターゲットメタボロミクス分析のデータを使用して、Mass Profiler Professional (Agilent Inc.) を使用して 2 因子主成分分析を実行し、プロバイオティクスの補給の前後で得られたサンプルのメタボロミクスプロファイルに違いがあるかどうかを判断しました。 マイクロアレイ分析とデータ分析の詳細は、オンライン サプリメントに含まれています。 |
| 3.結果 |
| 3.1.被験者募集 |
| この研究のために合計 23 人の被験者が募集されました。 2 人の被験者はスクリーニングに失敗し、除外されました。 1人の被験者は研究中に脳卒中を患い、研究のプロバイオティクス部分を完了する前に離脱した。 合計 20 人の被験者がプロバイオティクス介入を完了しました。 20 人の被験者のうち 13 人が、研究の追加のバンコマイシン介入部分に参加することに同意した。 これら 20 人の被験者のベースライン特性を表 1 に示します。 |
| 表 1:調査参加者の人口動態と特徴 |
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| 3.2.介入グループ別のベースラインの特性と変化 |
| プロバイオティクス介入段階 (表 2) では、総コレステロール (172±37 ～ 164±32 mg/dl、P=0.18) および LDL コレステロール (96±33 ～ 89±30 mg/dl) に有意ではない下降傾向が見られました。 dl、P=0.16）レベルは、トリグリセリド（P=0.47）およびHDL（P=0.22）レベルでは、顕著な差を示さなかった。 プロバイオティクスの補給後に収縮期血圧は上昇しましたが（132±11～138±12 mmHg、P=0.04）、拡張期血圧（P=0.49）、心拍数、体重（P=0.67）、BMI（P=0.76）は変化しませんでした。 バンコマイシンの補給は、総コレステロール、LDL および HDL コレステロール、トリグリセリド、体重、BMI、血圧、心拍数に変化をもたらしませんでした (表 2)。 血管測定: プロバイオティクスによる 6 週間の介入後、上腕動脈血流媒介拡張（FMD）% は全体で 3.55±1.96 % から 4.73±2.32 % に有意に増加しました (図 1A-B、P=0.004)。 この有意差は、Atkinson らの方法を使用したアロステリック リスケーリング後でも残りました (P=0.008)（29）。 プロバイオティクス介入段階を通じて、ベースラインおよびピーク充血せん断、静止直径、またはニトログリセリン媒介血管拡張に有意な変化はありませんでした（表 3）。 |
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図1 上腕動脈血流媒介拡張（FMD）%は、6週間のL. plantarum 299v補給後に有意に改善しました(3.55+1.96から4.73+2.32%、P=0.008)(A)。 上腕動脈血流媒介拡張（FMD）%の個々の変化が示されています(B)。 10 日間のバンコマイシン経口投与後、上腕動脈血流媒介拡張（FMD）% に有意な変化はありませんでした (4.05+1.90 ～ 3.8+2 %、P=0.73) (C)。 FMD - 血流媒介拡張 |
| 表 2: 研究介入前後の被験者の特徴 |
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| BMI：肥満指数。 LDL：低密度リポタンパク質。 HDL：高密度リポタンパク質 |
| 表 3: 研究介入前後の血管機能の測定値 |
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| 一般的な線形モデルでは、チエノピリジンの使用 (P=0.41) またはβ-ブロッカーの使用 (P-0.71) が我々の調査結果に及ぼす影響を実証できませんでした。 L. plantarum 299v補給による収縮期血圧の変化は、上腕動脈血流媒介拡張FMD%(r=0.09、P=0.70)または安静時上腕直径(r=-0.31、P=0.20)の変化とは関連しなかった。 バンコマイシン療法 (N=13) は、上腕動脈血流媒介拡張FMD% に有意な変化を示さなかった (図 1C、4.05±1.90 ～ 3.8±2 %、P=0.728)。 また、安静時直径、ベースラインおよびピーク充血剪断およびニトログリセリン媒介拡張は変化しなかった（表３）。 |
| 3.3.全体的な血漿代謝物含有量に対する L. plantarum 299v 補給の影響 |
| 被験者の血漿サンプルでは、合計 11,006 個の代謝産物が同定されました。 既知の溶出パターンに基づいて 2,0989 個が特定されました。 2 因子主成分分析の結果を図 2 に示します。合計 114 の化合物が、プロバイオティクス補給前と後の血漿サンプル間で P<0.05 で異なりました。 29人は陽性と特定されたが、85人は不明のままでした。 ボンフェローニ補正を使用した複数のテストの調整後、個々の代謝物は時点間で大幅に異なりませんでした。 |
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| 図2 プロバイオティクス補給前およびプロバイオティクス補給後のペアの血漿サンプルに対して実行された、非標的代謝物プロファイリングの二元配置主成分分析。 四角はL. plantarum 299v以前のサンプルを表し、三角形はL. plantarum 299v後のサンプルを表します。 |
| 3.4.ヒト微小血管の内皮依存性血管拡張に対するL. plantarum 299v補給後の血漿およびトリメチルアミンオキシド（TMAO）の影響 |
| 我々は、冠動脈疾患患者から得た 5 セットの皮下脂肪細動脈に対して 4 人の異なる被験者からの血漿を使用しました。 図 3 に示すように、プロバイオティクス後の血漿による治療は、内皮依存性のアセチルコリンに対する血管拡張を大幅に改善しました (L. plantarum 299v 補給前と後の全体で N=5、P=0.02、アセチルコリン用量 10-7 で P <0.004、 10−6、および10−5濃度）。 2 mM パパベリンに対する血管拡張反応には有意差はありませんでした (L. plantarum 299v 補給前と後では 98.6±1.7 対 97.6±2.6 %、P=0.50)。 L-NAME を使用すると、この改善は完全に無効になります (図 3A)。 別の一連の実験では、健康なボランティアの脂肪細動脈を 10 μM トリメチルアミンオキシド（TMAO）に 4 時間曝露しても、アセチルコリンに対する内皮依存性血管拡張は有意に損なわれませんでした (図 3B、N=4、P=0.65)。 プロバイオティクス後の血漿は、内皮が剥げた追加の細動脈の血管拡張には影響を与えませんでした (図 3C、P=0.40、N=3) |
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| 図3 L. plantarum299ｖ後血漿への６時間の管腔内曝露は、冠動脈疾患を有する被験者からの抵抗性細動脈の内皮依存性血管拡張を有意に改善した（すべての実験についてＮ＝５、全体でＰ＝０．０２、Achの示された濃度で＊−Ｐ＜0.004）。 この改善は、eNOS 阻害剤 L-NAME (A) によって完全にブロックされました。 10μM Tトリメチルアミンオキシド（TMAO）MAOによる4時間の管腔内曝露は、健康な被験者の細動脈における内皮依存性のAchへの血管拡張に有意な影響を与えません(N=4、P=0.65)(B)。 内皮露出は、L. plantarum 299v血漿に曝露される前および後の血漿に曝露されたヒト細動脈のアセチルコリン血管拡張反応を同等に無効にした(P=0.40)。 Ach-アセチルコリン。 |
| 3.5.血漿バイオマーカー |
| プロバイオティクスの補給により、循環炎症性サイトカイン IL-8 が 33 % (図 4A、14±7 から 10±4 pg/mL、P=0.01) 減少し、IL-12 が 21 % (図 4B、53±29 ～ 42±27 pg/mL、P=0.02) 減少しました。 L. plantarum 299v 補給の前後で、以下のサイトカインおよび循環接着分子の血漿レベルに有意な変化は見られませんでした:IL1β (中央値/IQR 0.83/1.37 vs. 0.66/1.45 pg/mL; P=0.37)。 TNF-α (中央値/IQL 8.80/65.10 vs. 7.30/39.30; P=0.38); IFN-γ (中央値/IQL 4.0/40.35 vs. 4.0/27.7 pg/mL; P=0.98); TGF-β (中央値/IQL 17.5/8.5 vs. 17.3/10.6 ng/mL; P=0.16); ICAM1 (23.9±5.2 vs. 24.0±7.9 ng/mL; P=0.99)、および VCAM1 (47.6±15.2 vs. 47.8±18.6; P=0.95)。 プロバイオティクス補給後も血漿Tトリメチルアミンオキシド（TMAO）濃度は変化しなかった[L. plantarum 299v前中央値1,03(四分位範囲0.62～2.20)対L. plantarum 299v後中央値1.41(四分位範囲0.71～4.15)。 P=0.27、図 5A-B)。 血漿レプチンレベルは補給後に有意に減少しました（図 5C ～ D、12.8±9.1 対 10.3±8.3 ng/mL P=0.001）が、アディポネクチンレベルは変化しませんでした(図 5E ～ F、5.09±3.51 対 5.00±3.99 μg/mL、P=0.85)。 酢酸の血漿レベルは有意に減少しました（オンライン図IA-IB、44.2±11.5対37.7±7.1μM、P=0.03）一方、プロピオン酸レベルは有意に増加しました（オンライン図IC-ID、31.5±.3.3対35.9μM、 P<0.001）。 酪酸の有意な変化は見られなかった(オンライン図1E-1F、0.80±0.31対0.83±0.28μM、P=0.66)。 |
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| 図4 全身性炎症性サイトカインに対する L. plantarum 299v 補給の影響。 IL-8の循環血漿レベルは、L. plantarum 299v補給により有意に減少した(14±7から10±4 pg/mL、P=0.01)(A)。 L. plantarum 299vも同様に、全身のＩＬ－１２レベルを低下させた（５３±２９から４２±２７ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．０２）（Ｂ）。 |
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| 図5 循環トリメチルアミンオキシド（TMAO）およびアディポカイン濃度に対するL. plantarum 299v補給の影響 |
| 血漿トリメチルアミンオキシド（TMAO）濃度は、プロバイオティクスの補給後も変化しませんでした (1.64±1.39 対 3.35±4.47 μM、P=0.27) (A および B)。 血漿レプチンレベルは補給後に有意に減少しました（2.8±9.1 対 5.00±3.99 μg/mL、P=0.85）。 |
| 3.6.マイクロバイオームプロファイリング |
| コミュニティの特徴付け: 各サンプルの豊富さ、多様性、分類学的構成を調べました。 細菌属の豊富さは 334 から 530 の範囲でしたが、古細菌属の豊富さは 8 から 25 の範囲でした。 測定時点ごとに、サンプルカテゴリで検出された細菌属の豊富さと科レベルの存在量に大きな変化はありませんでした(L. plantarum 299v 補給の前後、オンライン図 II)。 上位 9 クラスは、各サンプルの運用分類単位 (OTU、オンライン図 III) の約 67% を占めます。 上位 9 クラスのいずれも、プロバイオティクスの補給後に OTU 比率に有意な変化を示しませんでした (オンライン図 IIIB)。 |
| マイクロバイオーム全体の分析: マイクロバイオーム全体のデータを考慮して、ベータ多様性とサンプル間の明示的な比較を分析しました。 被験者のサンプルペア内の非類似性が低いため、ペアサンプルが考慮されていない場合、存在量メトリクスを使用した順序付けおよび階層的クラスタリング分析で観察された、治療前と治療後のサンプル間のマイクロバイオームの分離はありませんでした。 豊富な 2,206 分類群に基づく階層的クラスタリング分析では、プロバイオティクス補給の前後でサンプルの個別のクラスターが存在しないことが明らかになりました (オンライン図 IIB)。 それぞれのプロバイオティクス前およびプロバイオティクス後のペアサンプルのほとんどは、互いにグループ化されました。 |
| 3.7.プロバイオティクス治療前と後のサンプル間の一対の比較 |
| 対応のある t 検定を実行して、サンプルのペアリングを考慮しながら、時点に基づいて大幅に増加または減少した OTU を探しました。 すべての比較は、OTU の相対存在量を使用して実行され、ランク存在量でプロットされました。 70 個の重複する OTU があり、その存在量が補給前と補給後では大きく異なることが判明しました。 70 の OTU のうち 19 が属レベルで分類されました。 処理後のサンプルでは、LactobacillusおよびBacillus種が豊富に存在することが判明しました。 多重比較の調整前は、研究の全被験者からの治療前サンプルよりも治療後サンプルのほとんどでLactobacillus reuteriが豊富に存在していました（P=0.0014）（オンライン図IIC）。 OTU 番号 380、Lactobacillusの未分類分類群も、ほとんどの被験者の治療前サンプルよりも治療後サンプルに豊富に存在するようでした (P=0.0028) (オンライン図 IID)。 5% の誤検出率に合わせて調整した後、サンプリング ポイント間で大幅に異なる OTU はありませんでした。 未調整の分析で P<0.05 の 70 個の OTU すべてがオンライン表 I に示されています。 |
| 4.議論 |
| この研究は、腸内微生物叢が、冠状動脈疾患を患う男性の全身性炎症および血管内皮機能に機構的に関連していることを示唆しています。 生きた活性Lp299v培養物を含むGoodBelly™ StraightShotを6週間毎日補給すると、安定した冠動脈疾患を持つ男性の上腕動脈の内皮依存性血管拡張が大幅に改善されました。 さらに、L. plantarum 299v の補給により、炎症性サイトカイン IL-8 および IL-12 の循環レベルが大幅に低下したことから明らかなように、全身性の抗炎症効果がもたらされました。これらはどちらも白血球の産生、白血球、および内皮の活性化に重要な役割を果たすことが知られています。 L. plantarum 299v の補給によりレプチン レベルも低下し、動物モデルで行われた研究が確認され、L. plantarum 299v の抗炎症効果がさらに裏付けられました（34）。 L. plantarum 299v 補給後の血漿への曝露により、冠動脈疾患患者の抵抗性動脈の内皮依存性血管拡張が大幅に改善されました。 さらに、高濃度のトリメチルアミンオキシド（TMAO）への急性曝露は、健康なヒトの血管における内皮依存性の血管拡張に顕著な影響を与えませんでした。 短鎖脂肪酸（SFCA）のレベルは、血漿プロピオン酸の大幅な増加とそれに伴う循環酢酸レベルの減少を含め、L. plantarum 299vの補給により変化しました。 さらに、血漿代謝産物の主成分分析により、メタボロミクスプロファイルを使用して、血漿サンプルが L. plantarum 299v 補給の前に採取されたのか、後に採取されたのかを判断できることが実証されました。 便マイクロバイオームに関しては、便マイクロバイオームの全体的な豊富さ、多様性、または分類学的組成に変化は観察されませんでした。 OTUレベルの未調整の分析は、より大きなサンプルサイズで検証する必要があるLactobacillus属の種の変化の可能性を示唆しています。 |
| 総合すると、これらのデータは、我々の知る限りでは、プロバイオティクスL. plantarum 299vの経口補給が、NOの生物学的利用能の増加を通じて導管と抵抗血管の両方の冠動脈疾患を有する男性の血管内皮機能を改善し、同時に全身性炎症を軽減することを初めて実証している。 これらの効果は、従来の心血管危険因子に大きな好ましい変化がなかったにもかかわらず観察され、L. plantarum 299vの補給が、新規の未確認メディエーターを通じて少なくとも部分的に血管の健康に好ましい影響を与える可能性があることを示唆している。 この概念は、二因子主成分分析を使用して L. plantarum 299v 補給前後のサンプルを比較したときの血漿代謝産物プロファイルの明らかな違いによって裏付けられます。 さらに、我々の in vivo および ex vivo 血管データは、L. plantarum 299v の好ましい効果がトリメチルアミンオキシド（TMAO）とは無関係であることを強く示唆しています。 コリンの腸内微生物叢代謝の副産物として生成される トリメチルアミンオキシド（TMAO）は、冠動脈疾患患者における将来の有害な CV イベントの予測因子として、またアテローム発生、血小板活性化、および内皮の炎症と機能不全に機構的に関与している可能性があることが確立されています（7）。 したがって、我々のデータは、腸内マイクロバイオームを標的とした介入が、冠動脈疾患患者のトリメチルアミンオキシド（TMAO）産生に顕著な影響を与えることなく、血管リスクプロファイルに有利な影響を与える可能性があることを示唆している。 |
| プロバイオティクスの補給に関する動物研究は、腸内マイクロバイオームを標的としたこの治療法が血管系に有益な影響を与える可能性があるという概念を裏付けています。 VSL#3 (Streptococcus, Lactobacillus, および Bifidobacteria 属のプロバイオティクス 8 株の混合物) を投与されたラットは、一般的な胆管結紮モデルにおいて、血管の酸化ストレスが減少し、NO 依存性の血管弛緩が改善されたことが実証されました（35）。 同様の結果が、高血圧ラットモデルに複数のLactobacillus種を補給した場合にも見られました（36）。 高脂肪食で Lactobacillus coryniformis CECT5711 を補給された肥満マウスは、内皮依存性血管拡張の改善と血管酸化ストレスの軽減を示しました。 私たちの知る限り、ヒトの内皮機能に対するプロバイオティクスの影響に焦点を当てた唯一の以前に発表された研究は、12週間のLactobacillus casei 補給後のメタボリックシンドローム患者30人において循環VCAM-1の減少を実証したが、内皮機能の他の尺度では減少を示さなかった（38）。 研究サンプルでは、VCAM-1 または ICAM-1 のいずれにも変化は検出されませんでした。 研究間の違いは、研究期間、プロバイオティクスの種類、研究期間などの研究デザインの違いを反映している可能性があります。 |
| 私たちの研究は、プロバイオティクスの補給がNOの生物学的利用能を高めることによって血管内皮機能に直接的かつ有利な影響を与える可能性があり、この効果の大部分が腸内マイクロバイオームの代謝に由来する循環代謝産物の変化によって誘発される可能性が高いという概念をヒトにも大きく拡張したものである。L. plantarum 299v のようなプロバイオティクス介入の影響は、属および種特異的である可能性があり、腸内マイクロバイオームの組成に影響を与える宿主要因 (年齢、性別、肥満、流行している疾患など) によっても異なる場合があります。 そしてこれは私たちの研究とTripoltらの研究の間に見られる差異を説明する可能性があります（38-42）。 特定の患者集団の血管の健康を改善する特定のプロバイオティクス介入をより正確にターゲットにするには、この分野での追加の研究が必要となるでしょう。 |
| 内皮依存性の血管拡張と NO の生物学的利用能の改善に加えて、L. plantarum 299v の補給により、IL-8、IL-12、およびレプチンの全身レベルが低下しました。 内皮細胞は、単球を血管壁に動員するように作用する IL-8 を産生します。このことは、血管の炎症とアテローム発生における IL-8 の重要な役割を示唆しています（43、44）。 IL-12 は、細胞傷害性 T 細胞の活性化と単球の活性化を誘導するように作用し、血管の炎症とアテローム発生に寄与することが知られているさらなる炎症誘発性サイトカインの活性化をもたらします（45、46）。 観察されたレプチンレベルの減少は、現在の研究で使用されたのと同じL. plantarum 299v製剤を使用した共著者BakerとSalzmanによる以前のラット研究で観察された減少に類似しています（34）。 観察されたレプチンの減少は、誘発された心筋梗塞サイズの縮小および梗塞後の心筋回復の改善と関連していた。 体脂肪量が増加し、インスリン抵抗性が増加した個人ではレプチンレベルが上昇することが知られており、レベルの上昇は脂肪炎症に関連しています（47）。 さらに、レプチンは、血管機能不全やアテローム発生に寄与することが知られている複数の炎症誘発性細胞と炎症誘発性サイトカイン (IL-6、TNF-α、Th1 細胞、単核細胞、NK 細胞) の産生を活性化します（48-52）。他のいくつかの炎症マーカーには変化を見つけることができませんでしたが、全体として、我々の発見は、L. plantarum 299vの補給が全身性炎症を抑制する可能性を示唆しており、これは血管炎症の軽減、プラーク形成の減少、 プラークの安定性が向上します（53）。 |
| L. plantarum 299v 補給による好ましい血管効果の背後にあるメカニズムは依然として不明です。 血漿脂質およびグルコースレベルに変化が見られないこと、ならびに血圧のわずかな上昇が見られたことは、冠動脈疾患患者の男性を対象とした我々の研究において、血管機能および炎症に対するL. plantarum 299vの好ましい影響が従来の心臓危険因子とは無関係であることを示唆している。 しかし、L. plantarum 299v補給前後の血漿の非標的メタボロミクスプロファイリング、およびL. plantarum 299v後の血漿への直接急性曝露による内皮機能の改善を示すデータは、L. plantarum 299v 補給の好ましい効果は、腸内微生物叢の変化に起因する循環代謝産物 (または全身的に修飾されたその誘導体) の変化によって媒介されるという概念を強く支持しています。 サプリメント摂取後に有意に異なる単一の血漿代謝物はありませんでしたが、二因子 PCA 分析では全体的な代謝プロファイルの違いが実証されました。 私たちのデータは、トリメチルアミンオキシド（TMAO）が L. plantarum 299v 補給の改善効果に関与する代謝産物の 1 つであることを裏付けていません。 L. plantarum 299v 後の測定で トリメチルアミンオキシド（TMAO）測定値が高かった 2 人の被験者を除外した場合でも、有意な変化は見られませんでした (データは示さず)。 トリメチルアミンオキシド（TMAO）は、腸内微生物叢が血管機能、アテローム発生、プラークの安定性に影響を与える可能性がある多くの潜在的な代謝産物の 1 つですが、追加の非 トリメチルアミンオキシド（TMAO）代謝産物が心血管系の調節に関与している可能性が高いという概念は広く受け入れられています（7）。 |
| したがって、我々のデータは、血管内皮機能と全身性炎症に影響を与える、L. plantarum 299v補給によって変化する腸内マイクロバイオーム生成代謝産物の正体とメカニズムを解明するためにさらなる研究が必要であることを示唆している。 私たちの研究で考えられる原因の1つは、L. plantarum 299vの補給により増加したプロピオン酸-短鎖脂肪酸（SFCA）です。 結腸マイクロバイオームによる糖分解と発酵は、ヒトの循環 SCFA の圧倒的多数を占めます（54）。 最近のデータは、短鎖脂肪酸が、特定の 短鎖脂肪酸 に対して異なる親和性を持つ特定の G タンパク質共役受容体 (GPCR) との相互作用を通じて、腸内微生物の代謝と血圧および血管内皮機能とを結び付ける重要な細胞シグナル伝達分子であることを示唆しています。 興味深いことに、これらの GPCR の 1 つである遊離脂肪酸受容体 3 (FFAR3/GPR41) が、マウス血管内皮に存在することが最近証明されました（55）。 この受容体の活性化によりマウスでは血圧が低下し、内皮依存性の血管拡張が改善されますが、GPR41 が欠損したマウスでは血圧が上昇し、内皮依存性の血管拡張が障害されます（55-57）。 GPR41 の EC50 (11.6±1.4 μM) とプロピオン酸塩の用量反応曲線は、観察されたプロピオン酸塩濃度の増加が用量反応曲線の急峻な部分にあり、したがって観察可能な生物学的影響があると予想されることを示唆しています （58）。 FFAR2(GPR43) および FFAR3 はヒト単核細胞にも発現しており、それらの活性化によりヒト単球の炎症反応が抑制されます（59）。 これらの先行研究の文脈に適合すると、我々のデータは、全身のプロピオン酸塩の生物学的利用能の増加が、L. plantarum 299v の有益な効果の少なくとも一部を説明する可能性があることを示唆しています。 |
| L. plantarum 299v 補給後の血圧の緩やかな上昇が見つかりました。 これらのデータは、健康な男性と女性を対象とした、L. plantarum 299v 補給により収縮期血圧が低下したことを示した以前の小規模な研究と矛盾しています（60）。研究間の違いの理由は不明ですが、各研究の母集団（冠動脈疾患を患う高齢男性）の有意な違いと関係がある可能性があります。 （冠動脈疾患を患う高齢男性は現在喫煙者が5%しかいないのに対し、研究対象集団は著しく若く、性別のバランスが取れており、100%が現在喫煙者で構成されている）。 両方の研究の規模は小さいため、L. plantarum 299vの補給と収縮期血圧の関係を完全に解明するにはさらなるデータが必要であることが示唆されています。 |
| 私たちのデータにはいくつかの制限があります。 第一に、この研究は、L. plantarum 299v の補給がヒトの血管機能と全身性炎症に好ましい効果をもたらすかどうかを判断するために設計された小規模な介入的パイロット研究であり、さらなる研究が必要であるということです。 私たちの発見を検証し、効果のメカニズムをさらに評価するには、大規模なプラセボ対照ランダム化試験が必要です。 男性と女性の間の腸内細菌叢の組成に大きな違いがあるという複数の報告があり、これは部分的に性ホルモンに関連している可能性があることと、雄ラットから得られた予備データのため、このパイロットには男性のみが登録されました（34、40–42、61、62）。 したがって、私たちの結果を女性に一般化することはできず、適切な力を加えた性別階層化分析を提供するために、女性も前述の大規模研究に含めるべきである。 私たちの結果は安定した冠動脈疾患患者にのみ適用され、より健康な人々や他の慢性疾患を持つ人々に一般化することはできません。 この研究では個人の食事制限は行いませんでした。 個人レベルでは、食事は腸内マイクロバイオームの組成に影響を与える可能性がありますが、腸内マイクロバイオームの細菌系統は、さまざまな食事（低脂肪または低炭水化物など）を使用しても長期間にわたって著しく安定しています（62）。 食事介入の設定においてさえ、各個人の細菌群集は、他の個人の細菌群集と比較した場合よりも時間の経過とともにより類似します（63-67）。 サンプルサイズが小さいため、2206 OTU の比較について複数のテスト調整を行った後の分析では、Lactobacillus 種の大きな変化を確認できませんでした。 したがって、これらの発見は探索的であると考えられるべきであり、大規模な研究が正当であることを示唆しています。 これらの制限とバランスをとっているのは、プロバイオティクスの補給が血管の健康にどのような影響を与えるかについて、この研究が示唆する発見の新規性と新しいメカニズムの方向性です。 |
| 結論として、本発明者らは、L. plantarum 299vの補給により、安定した冠動脈疾患を有する男性において内皮依存性の血管拡張が改善され、全身性炎症が軽減されることを発見した。 好ましい変化には、内皮依存性の血管拡張によって測定されるNOの生物学的利用能の増加、およびIL-8、IL-12、およびレプチンレベルの低下が含まれます。 効果のメカニズムは、プロピオン酸塩を含む腸内マイクロバイオーム由来の循環代謝産物の変化を引き起こすプロバイオティクスに関連している可能性が高く、従来の心血管リスク因子とは独立しており、トリメチルアミンオキシド（TMAO）濃度の変化とは関連していないようです。 全体として、これらの発見は、プロバイオティクスサプリメントの的を絞った使用が男性の心血管リスクを軽減する効果的な方法である可能性があるという概念を裏付けています。 L. plantarum 299v、血管内皮機能の改善、および炎症の減少との関係の発見は、腸内細菌叢が心血管疾患の進行を予防および治療するための介入の有望な標的である可能性を示唆しています。 |
| 参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
| この文献は、Circ Res. 2018 Oct 12; 123(9): 1091–1102.に掲載されたLactobacillus Plantarum 299v Supplementation Improves Vascular Endothelial Function and Reduces Inflammatory Biomarkers in Men with Stable Coronary Artery Disease.を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |