Ruizhe Zhu et al., |
要約 |
| 導入 |
| 試験に対する不安は大学生によく見られる問題であり、身体的および精神的な健康に影響を与える可能性があります。 しかし、効果的な介入や治療戦略はまだ不足しています。 この研究は、試験を心配する大学生に対するLactobacillus plantarum JYLP-326 （以下L.plantarum JYLP-326）の潜在的な効果を評価することを目的としています。 |
| メソッド |
| 不安を抱えている学生 60 名が登録され、プラセボ群とプロバイオティクス群に無作為に割り当てられました。 両グループには、それぞれプラセボとL.plantarum JYLP-326製品を1日2回、3週間摂取するよう指示された。 何も治療を受けていない30人の不安のない学生が通常の対照グループに割り当てられました。 不安、うつ病、不眠症のアンケートは、この研究のベースラインと終了時の学生の精神状態を測定するために使用されました。 16S rRNA シーケンスと非ターゲット メタボロミクスを実行して、腸内細菌叢と糞便代謝の変化を分析しました。 |
| 結果 |
| アンケート結果は、L.plantarumJYLP-326の投与が、試験に不安を抱える学生の不安、うつ病、不眠症の症状を軽減できることを示唆しました。 プラセボ群の腸内微生物叢は、対照群よりも有意に高い多様性指数を示しました (p < 0.05)。 プラセボ群では属レベルでのBacteroides とRoseburia の存在量の増加が観察され、Prevotella とBifidobacteriumの相対的な存在量は減少しました。 一方、L.plantarum JYLP-326の投与は、乱れた腸内細菌叢を部分的に回復させることができた。 さらに、試験不安は、硫酸エチルの上昇やシクロヘキシルアミンの低下など、糞便メタボロミクスの障害と相関しており、L.plantarumJYLP-326の摂取後に回復する可能性がありました。 さらに、微生物叢と糞便代謝物の変化は不安関連症状と有意に関連していた。 |
| 結論 |
| この結果は、L. plantarum JYLP-326 の介入が、試験に不安を抱える大学生の不安、うつ病、不眠症を軽減する効果的な戦略となる可能性があることを示しています。 この効果の根底にある潜在的なメカニズムは、腸内微生物叢と糞便代謝物の調節に関連している可能性があります。 |
| 目次（クリックして記事にアクセスできます） |
| 2.材料と方法 |
| 2.1. L. plantarum JYLP-326 およびプラセボ製品 |
| 2.2. 参加者と実験計画 |
| 2.3. アンケート |
| 2.4. DNA 抽出と 16S rRNA シーケンス |
| 2.5. 糞便代謝物の分析 |
| 2.6. 統計分析 |
| 3. 結果 |
| 3.1. L. plantarum JYLP-326は学生の不安、うつ病、不眠症の症状を軽減します |
| 3.2. L. plantarum JYLP-326 は腸内微生物の多様性に影響を与えます |
| 3.3. 糞便微生物組成に対する L. plantarum JYLP-326 の影響 |
| 3.4. 各グループ間で変化した糞便代謝物の特定 |
| 3.5. L. plantarum JYLP-326 は不安を抱えた学生の糞便代謝の再構成を促進します |
| 3.6. メタボローム、マイクロバイオーム、表現型間の相関解析 |
| 4.討議 |
| 5.結論 |
| 本文 |
| 1. はじめに |
| 昇進のための重要な試験に直面したときの失敗、緊張、心配の感情を特徴とする試験不安は、大学生の間で広く発生します。 以前の研究 (1) では、大学生の約 20% ～ 40% が試験不安に苦しんでいることを報告しましたが、長期にわたる試験不安はうつ病や不眠症を伴うことが多く、学生の身体的および心理的健康を害し、自殺につながることさえあります。 さまざまな試験は、頻繁かつ重大な生徒の不安の原因となる可能性があります (2)。 たとえば、中国統一大学院入学試験 (UNGEE) は、学部生にとって大学院および修士号を申請する重要な機会ですが、熾烈な競争で知られています (3、4)。 特に、新型コロナウイルス感染症のパンデミック後の不安定な雇用市場から逃れるためにこの試験を受験する学生が増えており、試験の巻き込みが激しくなり、受験者の不安、うつ、不眠症などのストレス関連症状の程度が深刻化している。 |
| 不安な学生が試験のストレスによって引き起こされる健康上の脅威にどのように対処するかという問題は、非常に興味深いものです。 生徒の不安に対処するために、適切な栄養を補給する (5)、より多くの運動を行う (6)、薬を服用する (7) など、多くの対処法が提案されていますが、ほとんどの生徒は、次のような理由から食事による栄養や運動の必要性を無視する傾向があります。 UNGEE の準備が急務であること。 そして、FDA と学者の報告によれば、薬の服用は物質依存につながり、深刻な副作用を引き起こす可能性があります (8)。 したがって、学生が試験の準備中の不安を軽減するには、実践的で適度な介入や治療戦略を模索することが必要です。 |
| 最近、さまざまなプロバイオティクスが、腸の恒常性を維持し、粘膜および全身の免疫を改善し、腸内微生物叢の代謝を調節することにより、ストレスを受けた被験者に対して効果的なストレス調節および抗不安作用を有することが報告されています。 そのため、これらのプロバイオティクスは、精神障害を軽減するための次に有望な生きたサイコバイオティクスとなる(9-12)。 さらに、多くの感情障害（不安やうつ病など）と腸内細菌叢の異常または腸内代謝変化との間の強い相関関係が広く議論されており、腸内細菌叢と脳領域との間に固有の架橋があることが示されています。 それは微生物叢-腸-脳の軸として報告されています(13、14)。 したがって、プロバイオティクスの補給および/または糞便微生物叢の移植を通じて腸内微生物叢を標的にすることは、不安、うつ病、不眠症などの精神疾患を患い、慢性的にストレスを抱えている学生に対する代替治療法となる可能性があります(15)。 報告されているプロバイオティクスの中で、乳酸菌は、その相対的な存在量がストレスによって下方制御されているため、最も頻繁に研究されているプロバイオティクス種の1つです。 そして、ストレス誘発性の症状は、単一または複数の乳酸菌の投与によって改善される可能性がある(10、16、17)。 |
| Lactobacillus plantarum は、哺乳類の胃腸管ニッチにおいて生態学的および代謝的適応性を示す一般的に使用される乳酸菌であり (18)、ストレスを受けた動物モデルや群衆の不安やうつ病の重症度を軽減するためにますます人気が高まっています (19-22)。 その中でも、L. plantarum JYLP-326 は、Caco-2 細胞に効率的に接着し、不眠症ラットモデルの睡眠障害を改善できる分離株です (中国特許番号: CN 110791451 A)。 しかし、それが試験不安集団の不安、うつ病、不眠症の症状を軽減できるかどうかはまだ不明です。 ここでは、不安、憂鬱、不眠症などの試験ストレスによって引き起こされる行動に対する L. plantarum JYLP-326 の心理的影響を評価するために、近づく UNGEE に備えて準備をしている不安のある学部生 60 名と不安のない学部生 30 名を登録しました。 さらに、グループ間の腸内細菌叢と糞便代謝物の変化を、それぞれ 16S rRNA ハイスループット シークエンシングと非ターゲット メタボロミクスによって測定しました。 これらの結果は、L. plantarum JYLP-326 の介入が大学生の試験ストレス誘発症状の軽減に効果的であることを実証しました。 |
| 2.材料と方法 |
| 2.1. L. plantarum JYLP-326 およびプラセボ製品 |
| L. plantarum JYLP-326 は、中国広西省の巴馬地域で伝統的に発酵させられたもち米から分離され、2019 年 6 月 27 日に中国総合微生物培養収集センター (CGMCC、No. 18038) に特許取得済みのプロバイオティクス株として保存されています。 我々は、他のL. plantarum株よりもin vitroでより効率的にCaco-2細胞に接着できることを実証しました（補足図1A、図S1A）。 L. plantarum JYLP-326の投与と同様に、4-クロロ-DL-フェニルアラニン誘発性不眠症ラットモデルにおいて、睡眠潜時時間が効率的に減少し、総睡眠時間が増加した(図S1B、C)。 さらに、L. plantarum JYLP-326を摂取すると、ラットの視床下部のGABA含有量を標準レベルに戻すことができました（図S1D）。 プロバイオティクス製品とプラセボ（マルトデキストリン）製品は、中国山東省の中科嘉宜生物工学会社によって製造されました。 プロバイオティクス製品には、1 g の凍結乾燥 L. plantarum JYLP-326 粉末が 1 袋あたり 1.5 × 1010 CFU の固定用量で含まれており、賦形剤としてマルトデキストリンが含まれています。 各用量は高バリア複合アルミニウム小袋に包装されており、すべての小袋は同じ味の淡黄色の粉末として現れます。 すべての製品は中国で ISO9001 に基づいて製造され、中国食品医薬品局によって食品サプリメントとして承認されました (番号 SC10637078101504)。 小袋は直射日光にさらされずに 4 °C で保管されました。 製品の品質は、研究開始前に総生菌数法と 16S rDNA 配列決定によってさらに評価されました。 |
| 2.2. 参加者と実験計画 |
| 私たちは、大学4年生の試験ストレス誘発行動に対するL. plantarum JYLP-326の3週間のサプリメント摂取の効果を評価するためにこの研究を実施しました。 学生にとって試験準備の重要な時期である2020年9月から12月にかけて緊張しながらUNGEEの勉強をしていた学生が南昌大学から募集されました。 すべての手順は、南昌大学第二付属病院の医学研究に関する施設倫理委員会によって承認され、遵守されました（審査承認番号はレビュー[2020]番号（038）です）。 参加者全員が署名し、インフォームドコンセントを取得しました。 |
| その後、合計 230 人の学生が面接に登録され、14 項目のハミルトン不安尺度 (HAMA-14)、8 項目のアテネ不眠症尺度 (AIS-8)、および 17 項目のハミルトン評価に回答しました。 うつ病評価スケール (HDRS-17); 230人のうち、不安スコア8以上のベースラインHAMA-14とうつ病スコア8以上のHDRS-17を持つ60人がスクリーニングされた(1)、 また、スケールスコアが 8 以下の不安のない学生 30 名も同様にスクリーニングされました (図 1)。 包含基準は次のとおりです。 次のUNGEEテストの準備をしていた大学4年生。 健康な範囲内の肥満指数 (BMI)。 重篤な病気（癌、心臓疾患、肝臓疾患など）は報告されていません。 ホルモン避妊薬を使用していない女性被験者。 そしてこの研究を完了するために喜んで協力します。 除外基準は次のとおりです。肥満および糖尿病を患っている。 特定の病気のために定期的に薬を服用する。 長期にわたる喫煙と飲酒。 先月以内に抗生物質またはプロバイオティクス（ヨーグルトを除く）を摂取している。 被験者がこの研究を完了する可能性が低いその他の理由。 さらに、人間関係の失敗、家族ドラマ、経済的プレッシャー、特に社会不安障害を経験している被験者も除外されました。 |
 |
| 図 1 募集とグループ割り当てを示す研究フローチャート |
| UNGEE に直面している不安とうつ病を抱える 60 人の生徒のうち、30 人がプロバイオティクス製品を受ける PB グループとして無作為に選ばれました。 受け取った別の 30 のプラセボ製品を P グループとみなしました。 不安を感じていない 30 人の学生を健康な対照グループ (HP グループ) として割り当てました。 各グループの被験者は同年齢で、男性と女性の比率は 1:1 でした。 PB群とP群の被験者には、プロバイオティクス製品とプラセボ製品を1日2回、連続3週間、それぞれ2回の摂取の間に12時間の設定時間を設けて摂取するよう指示された。 一方、HP グループの学生は、通常のライフスタイルと食生活を維持するよう求められました。 すべての治療はUNGEE開始の2週間前に中止されました。 検証済みのアンケート（HAMA-14、HDRS-17、AIS-8）は、ベースライン（第 0 週）と介入終了時（第 3 週）の精神状態を決定するために提供されました。 被験者には、メーカーの説明書に従って、自宅で採便チューブを使用して自分で糞便サンプルを採取するように指示されました。 1 日で最初に排泄された糞便サンプルは、示された時点から 3 日間収集され、さらなる研究のために直ちに -80 °C で保存されました。 |
| 2.3. アンケート |
| 不眠症の症状の重症度は、中国語版 AIS-8 を使用して測定されました (23)。 これは、0 (睡眠関連の問題がないことを示す) から 24 (最も重篤な不眠症の程度を表す) までの範囲の合計スコアをカバーし、カットオフ スコア 6 が不眠症であると示唆されています (24)。 学生の抑うつ症状は、中国語版 HDRS-17 を使用して評価されました (1, 25)。 うつ病の症状の重症度は、HDRS スコアの重症度範囲に従って分類されました: 正常 (0 ～ 7)、軽度のうつ病 (8 ～ 16)、中等度のうつ病 (17 ～ 23)、および重度のうつ病 (> 23)。 不安症状は中国語版 HAMA-14 を使用して測定されました (1, 25)。 不安症状の重症度は、HAMA スコアの次の重症度範囲に従って分類されました: 正常 (0 ～ 7)、軽度または疑いのある不安 (8 ～ 14)、中等度または明確な不安 (15 ～ 21)、および重度の不安 (≧ 22) ）。 |
| 2.4. DNA 抽出と 16S rRNA シーケンス |
| 学生の糞便サンプル中の全ゲノム DNA は、TIANamp Bacteria DNA Kit (QIAGEN) を製造元の指示に従って使用し、ガラス繊維フィルターから抽出されました。 抽出されたゲノム DNA の濃度と品質は、分光光度計 (NanoDrop、Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国) を使用して測定されました。 抽出された DNA は、Shanghai Personal Biotechnology Cp Ltd.で 16S シーケンスを受けました。 以下のユニバーサル 16S rRNA プライマーを PCR 反応に使用しました: V4 領域には 520F (5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3') および 802R (5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3')、これらの PCR 産物は Illumina HiSeq 2000プラットホーム で配列決定されました。 FLASHを適用して重複したリードをマージし、UPARSEソフトウェアパッケージを使用して配列分析を実行しました。 品質スコアが 20 未満のリード、あいまいな塩基、および不適切なプライマーは、クラスタリングの前に破棄されました。 同時に、クラスタリング中にキメラがチェックされ、除去されました。 結果として得られた高品質の配列は、97% の類似性で操作分類単位 (OTU) にクラスター化されました。 分類群の注釈に従って、各サンプル中の総細菌の相対存在量が、さまざまな分類レベル (門、綱、目、科、および属) に分類されました。 アルファ多様性指数 (Shannon 指数および Chao1 指数) が計算され、ベータ多様性指数 (主成分分析、PCoA) が QIIME2 ソフトウェアでマッピングされました。 生のリードは、NCBI の Sequence Read Archive (SRA) データベースに保管されました (PRJNA883039)。 |
| 2.5. 糞便代謝物の分析 |
| 糞便中のメタボロミクスは、上海パーソナルバイオテクノロジーCp Ltdで分析されました。 四重極飛行時間型 (AB Sciex TripleTOF 6600) に接続された UHPLC (1290 Infinity LC、Agilent Technologies) を使用した。 重さ100 mgの便に、メタノール-アセトニトリル-水(2:2:1、体積/体積/体積)の抽出物400 mlを加え、ボルテックスし、14,000 gで20分間遠心分離し、さらなる測定のために上清を収集しました。 HILIC 分離では、2.1 mm × 100 mm ACQUIY UPLC BEH 1.7 µm カラム (waters、アイルランド) を使用してサンプルを分析しました。 ESI ポジティブ モードとネガティブ モードの両方で、移動相には A=25 mM 酢酸アンモニウムと 25 mM 水酸化アンモニウムの水溶液、および B= アセトニトリルが含まれていました。 RPLC 分離には、2.1 mm × 100 mm ACQUIY UPLC HSS T3 1.8 µm カラム (waters、アイルランド) を使用しました。 ESI ポジティブ モードでは、移動相には A= 0.1% ギ酸を含む水、B= 0.1% ギ酸を含むアセトニトリルが含まれていました。 ESI ネガティブ モードでは、移動相には A=0.5 mM フッ化アンモニウム水溶液および B= アセトニトリルが含まれていました。 生の MS データ (wiff.scan ファイル) は、無料で入手可能な XCMS ソフトウェアにインポートされる前に、ProteoWizard MSConvert を使用して MzXML ファイルに変換されました。 ピークの選択には、次のパラメーターが使用されました: centWave m/z = 10 ppm、ピーク幅 = c (10、60)、プレフィルター = c (10、100)。 ピークのグループ化には、bw = 5、mzwid = 0.025、minfrac = 0.5 を使用しました。 同位体と付加物の注釈には、CAMERA (代謝物 pRofile アノテーションのアルゴリズム集) を使用しました。 |
| 総ピーク強度に正規化された後、処理されたデータは R パッケージによって分析され、パレートスケール主成分分析 (PCA) および直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) を含む多変量データ分析が行われました。 7 分割交差検証および応答順列テストを使用して、モデルの堅牢性を評価しました。 OPLS-DA モデルの各変数の投影における変数重要度 (VIP) 値が計算され、分類への寄与が示されました。 VIP 値 > 1 の代謝物はさらに、単変量レベルで Student の t 検定に適用され、各代謝物の有意性が測定されました。 0.05 未満の p 値は統計的に有意であるとみなされました。 糞便メタボロミクスに関する生データは、Metabolomics Workbench (ST002475) および Metabolights (MTBLS7119) の公開データベースに保管されました。 |
| 2.6. 統計分析 |
| スピアマン相関分析は、R パッケージによって実行され、不安/うつ病スコアと主に変化した微生物の間の相関、および微生物と差次的代謝産物の間の相関を決定するために使用されました (26)。 統計分析は、Prism ソフトウェア バージョン 8.0 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 データは平均値±SDとして示されました。 統計的有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA) に続いて Tukey の多重比較検定を使用して分析されました。 p <0.05 のエラー確率は統計的に有意であるとみなされました。 |
| 3. 結果 |
| 3.1. L. plantarum JYLP-326は学生の不安、うつ病、不眠症の症状を軽減します |
| これらのグループの登録学生の間では、年齢と BMI の背景特徴に有意差はありませんでした (p > 0.05、表 1)。 HAMA-14、HDRS-17、AIS-8 のアンケートを使用して、ベースライン時（第 0 週）と治療終了時（第 3 週）の被験者の精神状態を評価しました。 健康な生徒と比較して、PB および P グループの被験者はベースラインで明らかな不安と抑うつを示しました (p < 0.001、表 1)。 HP グループでは、HAMA-14 不安スケール スコアと HDRS-17 うつ病スケール スコアの両方が、それぞれ 0 週目の 4.07 ± 1.51 および 2.83 ± 1.39 から、3 週目の 7.63 ± 2.40 および 6.83 ± 2.97 に劇的に増加しました。これは、健康な生徒の気分が良好であることを示しています。 試験が近づくにつれて、徐々に軽い不安とうつ病に変わりました（表1）。 P グループのこれら 2 つの指標は、この治療の終了時にわずかに増加しましたが、PB グループでは大幅に減少しました。 さらに、被験者の不眠症の重症度は、不安やうつ病のレベルと正の相関があった。 総合すると、これらの結果は、プロバイオティクス L. plantarum JYLP-326 サプリメントが、不安やうつ病、不眠症などの慢性ストレスに直面している被験者の生理学的障害や状態を軽減できることを示唆しています。 |
| 表 1 この研究に登録された被験者の特徴と、これらの尺度で評価されたテストの有効性結果 |
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データは平均±SDとして示されました。 n は数値を指します。 BMI、ベースライン肥満指数。 a 14 項目のハミルトン不安スケール (HAMA-14) を使用して不安症状を評価しました。 b 17 項目のハミルトンうつ病評価スケール (HDRS-17) を使用して、うつ病の症状を評価しました。 c 8 項目のアテネ不眠症スケール (AIS-8) を使用して、不眠症の症状を評価しました。 *グループ内、ベースライン (0 週目) と比較、*p < 0.05、**p < 0.001、***p < 0.001、****p < 0.0001。 ns は意味を示しません。 大文字は、グループ間での Tukey の多重比較検定、p < 0.001 を指します。 |
| 3.2. L. plantarum JYLP-326 は腸内微生物の多様性に影響を与えます |
| すべての被験者は、自主的に糞便サンプルを提供するよう求められました。 しかし、最終的には、16S rRNA ハイスループット シーケンス分析を実行するために、HP グループから 25 個、P グループから 20 個、PB グループから 20 個の糞便サンプルを収集しました。 また、P グループの 2 サンプルと PB グループの 1 サンプルはシーケンス ライブラリーを確立できませんでした。 Chao 1 と Shannon 指数が示したように、これら 3 つのグループ間では腸内細菌叢の α 多様性指数に差があり、試験不安がヒトの腸内細菌叢のバランスを乱す可能性があることが示唆されました (図 2A)。 特に、P グループの Chao 1 指数とシャノン指数は HP グループの指数よりもわずかに高かったのに対し、L. plantarum JYLP-326 は試験不安によって妨げられた腸内細菌叢の多様性を回復できました (図 2A)。 さらに、PCoA分析により、PB群のヒト腸内細菌叢のβ多様性はHP群と類似しているが、P群とはわずかに異なることが実証され、試験不安がヒトの構造に影響を与えていることがさらに示唆されました。 腸内微生物叢とプロバイオティクス L. plantarum JYLP-326は、腸内微生物プロファイルを再構築する可能性があります (図 2B)。 さらに、すべてのサンプルで合計 10,471 個の OTU が特定されましたが、3 つのグループに共通する OTU は 10% 未満 (964/10,471) であり、P グループでは OTU の 32.37%、P グループでは 28.51% のみでした。 PB グループの OTU は HP グループと共有されており、試験不安が腸内に生息する種の種類に影響を与える可能性があり、JYLP-326 単独による治療ではこの変化をほとんど再形成できないことが示されました (図 2C)。 |
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| 図2 腸内微生物の多様性に対する L. plantarum JYLP-326 の影響 |
(A) 腸内細菌叢の Chao1 指数と Shannon 指数。 (B) 腸内細菌叢の PCoA 分析。 ( C) 腸内微生物種のベン図。 HP、おやつなしの通常の対照グループ。 P、プラセボを摂取するPグループ。 PB、プロバイオティクス L. plantarum JYLP-326 を摂取する PB グループ。 ∗ p < 0.05。 |
| 3.3. 糞便微生物組成に対する L. plantarum JYLP-326 の影響 |
| 門レベルでは、Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria およびProteobacteriaがこれらのグループで最も一般的な集団であり、これら 3 つのグループの総シーケンス結果のそれぞれ 99.76%、99.53%、および 99.30% を占めました (図 3A)。 注目すべきことに、Firmicutes,の相対存在量は、P グループで 45.28% であり、HP グループ (32.51%、p = 0.041) よりも有意に高かったのに対し、L. plantarum JYLP-326の投与によってわずかに回復する可能性がありました。 対照的に、P グループ (10.96% および 5.45%) におけるActinobacteria およびProteobacteriaの相対存在量は、HP (15.26% および 13.83%) および PB グループ (12.44% および 16.76%) よりも低かった。 さらに、Bacteroidetes,の含有量は、その相対的な存在量がP群とHP群間で非常に類似していた(38.04%対37.13%)ため、試験不安の影響を受けなかったが、L. plantarum JYLP-326による治療によって減少させることができた。 |
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| 図3 腸内微生物組成に対する L. plantarum JYLP-326 の効果 |
(A) 門レベルでの腸内細菌の相対的な存在量。 (B) 属レベルでの腸内細菌の相対的な存在量。 HP、何の治療も受けていない正常な対照群。 P、プラセボを摂取するPグループ。 PB、L. plantarum JYLP-326を摂取するPBグループ。 ∗ p < 0.05。 |
| 属レベル (図 3B) では、P グループの生徒の糞便微生物スペクトルは、HP グループ (16.89% および 14.05%) よりもPrevotella (11.80%) およびBifidobacterium (9.98%) が豊富ではありませんでしたが、 HP グループ (16.61% および 2.73%) よりもBacteroides (19.90%) およびRoseburia (6.47%) が相対的に豊富でした。 そして、PB グループにおけるそれらの相対存在量は、それぞれ 12.12%、11.69%、11.73%、および 3.25% でした。 これらの結果は、L. plantarum JYLP-326による治療により、腸内微生物叢の標準状態への変化傾向を部分的に逆転させることができることを示しました。 注目すべきことに、P グループのRoseburiaの存在量は HP グループよりも劇的に高かった (p = 0.0397) のに対し、プロバイオティクスL. plantarum JYLP-326を摂取すると、この属の変化傾向を排除できた。 まとめると、これらの結果は、L. plantarum JYLP-326の投与が、特にBacteroidesとRoseburiaの減少、PrevotellaとBifidobacteriumの増加において、試験不安によって誘発される腸内細菌叢の組成の変化を改造できることを示した。 |
| 3.4. 各グループ間で変化した糞便代謝物の特定 |
| 品質管理 (QC) サンプルはサンプル コホートに挿入され、テスト システムの安定性と実験データの信頼性を監視および評価しました。 すべての QC サンプルの各クロマトグラフィー ピークの応答強度と保持時間は、トータル イオン クロマトグラムでほぼ重複しており (図 S2)、すべての QC サンプルは ESI- および ESI+ モードでクラスター化されていました (図 4A、B)。 得られた分析データは信頼性があり、分析システムは安定していました。 さらに、PCA 分析に基づくと、これら 3 つのグループ間に明らかな分離はなく、試験不安とプロバイオティクス L. plantarum JYLP-326 が糞便代謝プロファイルの変化に大きな影響を与えないようであることが示されました。 サンプル中の代謝物の詳細情報を検索して照合するために、ローカルで独自に構築された標準製品データベース ライブラリが採用され、合計 2,791 個の代謝物（ESI+ モードで 1,818 個、ESI- モードで 1,153 個）が抽出されました。 複合アノテーションの新しい信頼レベルのレベル 2 で識別されます。 化学分類情報によると、代謝産物の 28.04% が脂質および脂質様分子のスーパークラスに分類され、20.09% が有機酸および誘導体、13.36% が未定義のスーパークラスに分類されました (図 4C)。 |
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| 図4 グループ間の糞便メタボロームプロファイリング |
(A) ESI+ モデルの PCA プロット。 (B) ESI モデルの PCA プロット。 (C) 同定された糞便代謝物のスーパークラス。 HP、正常対照群のサンプル (n=25、緑色のボックス)。 P、P グループのサンプル (n=20、紫色の円)。 PB、PB グループのサンプル (n=20、ピンク色の三角形)。 QC、品質管理サンプル (n=7、黄色のひし形)。 |
| 3.5. L. plantarum JYLP-326 は不安を抱えた学生の糞便代謝の再構成を促進します |
| これらのグループ間の差次的な代謝物を調査するために、OPLS-DA モデルを使用してグループ間の差分変数、および OPLS-DA によって取得された投影の変数重要度 (VIP) の値 (VIP > 1) と p 値 (p < 0.05) を 2 つのグループ間で変化した代謝物をスクリーニングするための基準として使用します。 ESI-モード(図S3A〜C)とESI+モード(図S3D〜F)ではグループ間の明確な分離が観察され、OPLS-DAモデルがサンプルを効果的に区別できることを示唆しています。 さらに、潜在的な代謝産物をスクリーニングするために、変化倍率の値 (FC > 1 または < 1) および P 値 < 0.05 を持つ変数を選択しました。 ベン図は、ESI- モードでは合計 95 の代謝産物の変数、ESI+ モードでは 105 の代謝産物の変数がスクリーニングされたことを示しました (図 5A、B)。 これらの代謝産物の詳細情報は、補足表 1、2 に記載されています。 KEGG 濃縮分析散布図は、これらの変数が、炭素またはエネルギー代謝、インスリン抵抗性、神経活性リガンドと受容体の相互作用、およびビタミンの消化と吸収の主要経路で大幅に濃縮されていることを示しました (図 5C)。 |
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| 図5 示差的代謝産物のパスウェイエンリッチメント分析 |
(A、B) ESI+ および ESI- モードでの差次的代謝物のベン図。 合計 200 の差次的代謝物がベン図に示されました。 (C) これらの変化した代謝物の KEGG 濃縮分析。 散布図は、さまざまな経路における差次的代謝産物の濃縮を示しています。 |
| 一方、P 対 HP と PB 対 P の交点には 13 個の変数があり (表 2)、プロバイオティクス L. plantarum JYLP-326に関連する変数のサブセットを形成しました。 HP グループと比較して、8 つの変数 (L-グロノ-1,4-ラクトン、硫酸エチル、キネート、D-グルカル酸、1,2-プロパンジオール、3-(1,3-ベンゾジオキソール-5) の相対レベル) -イル)-、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール硫酸塩、ベタイン、トリゴネリン) は P グループで有意に増加しました (FC > 1 および p < 0.05)。 また、5 つの変数 (フェンプロピジン、パルミトイル 3-カルバサイクリック ホスファチジン酸、5 ベータ-アンドロスタン-3 アルファ-オール-17-オン硫酸塩、ビオシチン、シクロヘキシルアミン) の相対レベルは明らかに減少しました (FC < 1 および p < 0.05)。 。 一方、これらの変数は、フェンプロピジンの代謝物を除いて、L. plantarum JYLP-326 治療後に標準レベルに戻る可能性があります。 これらの結果から、これらの変数が学生の試験不安に対するプロバイオティクス L. plantarum JYLP-326 の代謝マーカーである可能性があるとの結論に至りました。 |
| 表 2 HP、P、PB グループ間で大きく変化した 13 種類の代謝物の詳細情報 * |
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* 各グループにおけるこれらの代謝産物の相対的な存在量は、Metabolomics Workbench (ST002475) および Metabolights (MTBLS7119) の公開データベースに登録されています。 am/z は各代謝産物の質量電荷比を意味します。 brt(s) は、クロマトグラフィーにおける代謝産物の保持時間、つまりピーク時間を指し、秒単位で表されます。 cVIP、投影の変数重要度。 値が大きいほど重要です。 dFC は、比較したグループにおける代謝物の変化倍数を意味します。 |
| 3.6. メタボローム、マイクロバイオーム、表現型間の相関解析 |
| 次に、腸内細菌叢の属 (上位 6 つ)、13 の異なる代謝産物、および不安症状の間の関連性を調査するために、スピアマン相関分析が実行されました (図 6)。 私たちは、Bacteroides, Faecalibacterium, Roseburia, およびBlautiaが、学生の試験ストレスによって誘発される試験不安と正の相関があることを観察しました。 特に、Faecalibacterium, Roseburia,は互いに有意に関連しており、Bacteroidesと正の相関があり、Prevotellaと負の相関があった。 また、PrevotellaはBifidobacteriumやFaecalibacterium,とも負の相関を示しました。 13 の代謝物のうち、8 つは互いに正の相関がありましたが、残りの 5 つは負の相関がありました。 注目すべきことに、シクロヘキシルアミンと不安症状の間には顕著な負の相関があり、硫酸エチルと試験ストレス誘発性不安の間には顕著な正の相関があった。 さらに、13 の代謝産物は、Roseburia および Blautia と負の相関があるようでした。 さらに、うつ病/不眠症、13の代謝産物、および6つの変化した腸内微生物の間の相関は、不安の相関と同様でした(図S4A、B)。 これらの結果は、腸内微生物叢とその代謝の変化が試験ストレス、うつと関連しており、試験不安を誘発することを示唆している。 |
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| 図6 不安行動、腸内微生物叢、および糞便代謝産物間のスピアマン相関分析 |
不安症状スコア、表 2 の 13 の代謝産物、および腸内微生物叢の相対存在量の上位 6 つ間のスピアマンの順位相関係数。 P 値は赤と青で表され、赤は負の相関を示し、青は正の相関を示します。 ∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、∗∗∗p < 0.001。 |
| 4.討議 |
| 学業試験は、大学生にとって短期間の自然主義的ストレスの主な原因であり、腸内微生物叢の変化とともに心理的ストレス反応を調査し、ストレス誘発性合併症に対するプロバイオティクスまたはプレバイオティクスの影響を評価するためのストレスモデルとして頻繁に使用されています（ 27）。 この研究では、激しい退縮を特徴とするUNGEEを受けている健康な大学生が登録され、L. plantarum JYLP-326のストレス関連症状に対する潜在的な効果を評価しました。 その結果、L. plantarum JYLP-326を 3 週間にわたって毎日補給した (1 日 2 回) と、大学生の不安/うつ病、不眠症が大幅に軽減されたことが示されました。 機構的には、プロバイオティクス治療は、ストレスイベントによって乱された腸内微生物叢の多様性と組成の変化を促進する可能性があり、これには機能的な代謝変化が伴います。 現在のデータはさらに、腸内細菌叢と脳との間の双方向の伝達経路[すなわち、腸-脳軸(28)]を示し、不安を抱えている被験者におけるプロバイオティクスの有益な心理的効果を検証した(29、30)。 |
| 不安、うつ病、不眠症のレベルは、HAMA-14、HDRS-17、AIS-8 などの最も一般的に使用されるメンタルヘルス質問票によって測定されました (1、23)。 P グループと PB グループの生徒は、ベースラインで軽度の睡眠障害を伴う中程度の不安とうつ病を示しました。 HP グループと P グループでは、この研究の終了時にスケールスコアが著しく向上しており、これらの指標のレベルが強化されており、近づく UNGEE 試験中にさらに悪化することが示唆されています。 注目すべきことに、プロバイオティクス L. plantarum JYLP-326治療は、うつ病と睡眠の質を通常と中程度の境界線まで大幅に軽減し、不安の悪化を防ぎました (表 1)。 これらのデータは、L. plantarum 単一株 (例、P8、PS128、DR7) がストレスを受けた被験者のストレス、不安、不眠症を軽減するという以前の結果とよく裏付けられました (20、21、23、31)。 L. casei (Shirota) (27)、L. rhamnosus (16)、および L. plantarum を含む複数菌株製品 [例: UBLP40 (17)、R1012 (11)、SK321 (32)] などの他の乳酸菌種も、 精神障害やストレス誘発性の行動を調節することが報告されています。 これらの発見は、乳酸菌のようなプロバイオティクスが試験の不安とそれに関連する症状の軽減に潜在的な影響を与えることを示しました。 |
| 証拠を考慮すると、プロバイオティクスの介入により微生物集団のバランスが取れ、それによって健康な腸の恒常性が生み出され、生命システムをサポートできる可能性があることが示唆されました。 一般に、腸内微生物叢の多様性が高いということは腸内環境が良好であることを意味するという仮定があり、これは腸内微生物の多様性の低下を伴ういくつかの症状（例：がん、胃腸障害、ストレス関連症状）によって証明されています(22)。 ただし、ここで示したデータは、腸内細菌叢のα多様性が大幅に増加していることが判明したため、観察された結果とは一致しませんでした（つまり、シャノン指数とチャオ1指数）。 また、健康な対照群と比較して、プラセボ群ではβ多様性がわずかに変化しています（PCA分析）（図2）。 別の学者は、多様性の測定は必ずしも群集の結果の答えに関連しているわけではなく、生態学的メカニズムをさらに研究するための出発点であると考えました(33)。 |
| 我々の結果は、ストレス関連疾患の悪化に伴ってBacteroides, Faecalibacterium, およびRoseburiaの含有量が明らかに増加する一方、Prevotella と Bifidobacterium の含有量が減少することを示した。 一方、L. plantarum JYLP-326処理はこれらの細菌のドリフトを部分的に逆転させました (図 3)。 ストレスを受けた被験者にL. plantarumを摂取させた後、B. adolescentis (34)、B.longum (35)、F. prausnizii (36)などの一部のBifidobacteriumおよびFaecalibacterium,特異的種は上方制御され、R. faecis (22)は下方制御されることが判明した。 腸内細菌叢の重要な属であるLactobacillus,は、精神的健康と有意な相関関係があり、抗不安作用および抗うつ作用があることも報告されています(37)。 しかし、Lactobacillus,の相対存在量は非常に低かったため、グループ間での変化はほとんど見られませんでした。 この観察の考えられる説明は、16S 配列決定の冗長手順によりLactobacillus,の情報が失われ、分離された L. plantarum JYLP-326 でさえ腸内に定着できなかったということでした。 注目すべきことに、ここで提示された相関分析データは、別の研究の結果と同様に、Roseburiaがストレス関連症状と正の相関があることをさらに発見しました(図6)。 これらの結果は、特定の腸内微生物種とその相対的な豊富さが、ストレス誘発性障害の進行から身を守る上で重要な役割を果たしているということを裏付けています。 |
| さらに、腸内微生物の代謝作用または腸内微生物由来の代謝産物は、微生物叢-腸-脳軸を介した腸と脳間のコミュニケーションを促進する主要な経路です(37)。 短鎖脂肪酸 (SCFA) (38)、胆汁酸 (39)、およびγ-アミノ酪酸 (GABA) (40) やドーパミン (41) などの一部の神経伝達物質は、一般にこの伝達に潜在的に関与する代謝産物でした。 ここでは、これらのグループ間の非標的代謝分析によって 200 の異なる糞便代謝物が同定されました。 これらは、ビタミンの消化と吸収、神経活性リガンドと受容体の相互作用、インスリン抵抗性、炭素またはエネルギー代謝などの経路が豊富でした（図5）。 腸内細菌叢が合成したビタミン (すなわちビタミン K2) は、ショウジョウバエのパーキンソン病 (PD) 関連のミトコンドリア欠損を修復する神経保護剤である可能性があります (42)。 他の研究者と我々は、インスリン抵抗性がパーキンソン病のような神経変性疾患と密接に関連しており、脳のインスリンシグナル伝達障害がこれらの疾患における神経機能不全に寄与する特徴であると示唆した(43、44)。 これらの結果は、ストレス誘発性疾患が糞便メタボロミクスの乱れと関連していることをさらに示唆しました。 |
| それらのうち、13 個の変数がプロバイオティクスL. plantarum JYLP-326治療に関連するサブセットを形成し (表 2)、Prevotella と正の関係があったシクロヘキシルアミンを除いて、乱れた腸内微生物叢とほぼ負の相関があるように見えました (図 6)。 さらに、シクロヘキシルアミンは不安/うつ病の症状と負の相関があることが判明しました。 対照的に、硫酸エチルはこれらの疾患と正の関連性を示しました。 窒素含有複素環部分とシクロヘキシルアミンのようなその誘導体は、うつ病の治療に成功していることが証明されています(45)。 そして、硫酸エチルは、一連の精神病性障害を引き起こすアルコール依存症の血清中のバイオマーカーであると考えられています(46)。 この研究では、糞便代謝物中の頻繁に言及される 短鎖脂肪酸 とγ-アミノ酪酸の変化は観察されませんでしたが、我々の結果は、ストレス関連症状の発症に関与するいくつかの新規化合物を提供しました。 これは、L. plantarum JYLP-326 のようなプロバイオティクスの投与によって調節されると考えられます。 不安やうつ病などのストレス関連症状に対するプロバイオティクスの有効性に関与する変数の正確な機能を説明するには、さらなる研究が行われる必要があります。 |
| この研究では、乱れた腸内微生物叢の再構築におけるL. plantarum JYLP-326の潜在的な役割が示されていますが、この効果がプロバイオティクスの投与によって引き起こされたのか、それとも被験者間の個人差によって引き起こされたのかはまだ不明です。 さらなる比較分析のための追加の対照群として、治療前に糞便サンプルを収集することにより、腸内微生物叢とその代謝の結果に対する腸内微生物叢の不均一性の影響を考慮する方がよいでしょう。 さらに、試験不安関連精神障害の軽減における L. plantarum JYLP-326の根本的なメカニズムも、不安/うつ病動物モデルと高度な分子技術を使用して深く調査される必要があります。 特に、微生物叢、腸、脳の軸を、将来的にプロバイオティクスL. plantarum JYLP-326の生物学的機能とどのように結び付けるかについては、臨床におけるプロバイオティクスの応用における重要な問題です。 |
| 5.結論 |
| 結論として、本研究では、プロバイオティクスL. plantarum JYLP-326の投与により、試験に不安を抱える大学生の不安/うつおよび不眠症の症状が大幅に軽減される可能性があることが観察されました。 腸内微生物叢の構造と組成は、糞便代謝物の変化と同様に、激しい退縮を伴う重要な検査に合格しなければならないというプレッシャーによって変化しました。 具体的には、L. plantarum JYLP-326治療は、この検査のストレスによって引き起こされる腸内微生物叢の腸内細菌叢の異常および糞便のメタボロームの乱れから保護しました。 さらに、変化した腸内微生物叢属と糞便代謝産物は、不安/うつ病、不眠症などのストレス関連症状と密接に関連しており、これらがストレスや不安障害の診断と治療のためのバイオマーカーとみなされる可能性があることを示しています。 |
| 参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
| この文献は、Front Immunol. 2023; 14: 1158137に掲載されたPsychobiotic Lactobacillus plantarum JYLP-326 relieves anxiety, depression, and insomnia symptoms in test anxious college via modulating the gut microbiota and its metabolismを日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |