Haichao Wen et al., |
概要 |
| ブラックチョークベリー（アロニアメラノカルパ）の果実は、抗酸化作用を持つ重要な二次代謝産物であるアントシアニンが豊富です。この研究の目的は、模擬移動床（SMB）クロマトグラフィーによってブラックチョークベリーからアントシアニンを分離および精製し、ラットのアミロイドβ（Aβ）誘発性記憶損傷に対する模擬移動床精製アントシアニンの神経保護効果を調査することでした。模擬移動床プロセスのパラメーターが調査され、最適化されました。アントシアニン抽出物をHPLC（訳者注：高速液体クロマトグラフィー）およびUPLC-QTOF-MS（訳者注：高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析）で同定し、抗酸化能を評価しました。アミロイドβ誘発動物モデルは、ラット脳への脳内心室注射によって確立されました。模擬移動床精製により、アントシアニンは85％まで精製されました。シアニジン3-O-ガラクトシドおよびシアニジン3-O-アラビノシドは、UPLC-QTOF-MSによって主要なアントシアニンとして同定されました。 模擬移動床クロマトグラフィー精製アントシアニンは、粗アントシアニン抽出物よりも高いDPPH（訳者注：2, 2-Diphenyl-1-pycrylhydrazyl、抗酸化力の測定試薬）およびABTS(訳者注：2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、抗酸化能の測定試薬)フリーラジカル捕捉能力を示しました. さらに、模擬移動床精製アントシアニン処理（50 mg / kg）を受けたラットは、モリス水迷路試験で空間記憶の改善、およびアミロイドβ毒性に対する海馬の細胞の保護を示しました。これらの結果は、アントシアニンが抗酸化剤および神経保護剤として機能し、アルツハイマー病の治療に役立つ可能性があることを示しています。 |
1.はじめに |
ブラックチョークベリー（アロニアメラノカルパ）は、観賞用植物として、また食品や着色剤として使用されています。 アントシアニンやフラボノイドなどの二次代謝産物が豊富で、酸化ストレスや生物的ストレスからの保護に重要な役割を果たします[1]。 ブラックチョークベリーの主なアントシアニンは、シアニジン3-O-ガラクトシド、シアニジン3-O-アラビノシド、シアニジン3-O-グルコシド、およびシアニジン3-O-キシロシドです。 これらの化合物は、抗酸化、抗増殖、抗菌、抗炎症などの多くの生物活性を示し、肝臓の脂質代謝活性を調節します[1–4]。 一方、アントシアニンは、心血管疾患、肝不全、肥満、糖尿病などの病気を予防および治療することが示されています[5]。 さらに、アントシアニンは血液脳関門（BBB）を通過し、老化に関連する変性疾患を遅らせる可能性があります[6–8]。 ただし、アントシアニンの安定性は、構造、溶媒の存在、pH、温度、酸素、酵素、その他の付随物質などの多くの要因の影響を受けます。そのため、複雑な天然化合物から単量体アントシアニンを単離および精製することは依然として不可能です[9] |
| 神経変性疾患はますます蔓延しており、影響を受けた個人の家族に生活と経済的負担をもたらしています。 認知症の最も一般的な原因の1つであるアルツハイマー病（AD）は、アルコールの使用、喫煙、高血圧、金属への曝露、酸化ストレスなどの多くの危険因子に関連しています[10]。 アルツハイマー病の特徴は、細胞外空間のプラークと血管壁に不溶性のアミロイドβが蓄積することです[10]。 アルツハイマー病の病因は完全には理解されていませんが、多くの研究が、活性酸素種（ROS）が抗酸化防御システムを損ない、ニューロンのアポトーシスを誘発するという仮説を支持しています[11]。 イチョウのフェノール化合物、緑茶、クルクミン、ブドウ、ブルーベリーなどの多くの二次代謝産物は、invivoおよびinvitroモデルで酸化ストレスから神経細胞を保護することが報告されています[12–16]。 |
| 模擬移動床クロマトグラフィーは、グルコースやフルクトース[17]やキラル薬物などの化合物の大規模生産のための分離段階で使用されてきた連続向流プロセスです。 模擬移動床クロマトグラフィーは、数グラムの熱的に不安定な化合物[18]とキラル薬物の分離を特徴としますが、これらは物理化学的特性の点でほとんど違いがありません[19]。セミ分取液体クロマトグラフィーと比較して、模擬移動床はより少ない吸着剤と溶媒を必要とし、ターゲット化合物は低損失で誘導される可能性があります[17,20]。模擬移動床はフェノール化合物などの不安定な二次代謝産物の分離に適していますが、その使用に関するさらなる研究が必要です。 私たちの知る限りでは、この研究は、模擬移動床クロマトグラフィーによってアントシアニンを分離および精製し、ラットの酸化ストレスに対する保護効果とアミロイドβ誘発性損傷に対する神経保護能力の両方を研究する最初の研究です。 |
| この研究の具体的な目的は、ブラックチョークベリーからアントシアニンを分離および精製するための新しい高効率の方法を開発し、模擬移動床精製アントシアニン抽出物の抗酸化活性を調査することです。 アミロイドβ誘発損傷動物モデルを使用して、模擬移動床精製アントシアニンが空間学習と記憶能力、およびinvivoでの神経細胞の生存能力に及ぼす影響をテストしました。 |
| 2 材料と方法 |
| 2.1 化学薬品 |
| シアニジン3-O-グルコシド標準（99％）は、Sichuan Weikeqi Biological Technology CO.,LTD（Chengdu,Sichuan,China）から購入しました。 シアニジン3-O-ガラクトシド（Cyn-3-gal、95％）は、HaoChen Ecological Agriculture Development CO.,LTD（上海、中国）から入手しました。 A 1–40ペプチドは、Beijing Biosynthesis Biotechnology CO.,LTD（北京、中国）から購入しました。 1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）および2,20-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）、6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン- 2-カルボン酸（Trolox）は、TCI（Shanghai）Development CO.,LTD（Shanghai、China）から購入しました。 他のすべての有機溶媒は分析グレードのものでした。 |
| 2.2 植物材料 |
| ブラックチョークベリーの果実は、2017年9月に完全成熟段階で、瓦房店市（39 49021 "N、121 54032" E、大連、遼寧、中国）のブラックチョークベリー実証植栽基地から収穫されました。 果物は4℃で輸送され、最大6か月間40℃で保管されました。 |
| 2.3 アントシアニンの抽出 |
| ブラックチョークベリーの果実を粉砕し、ステンレス鋼ブレンダーを使用して均質化し、次に超音波浴で10分間、1％酢酸を含む1：8（w / v）比の65％エタノールで2回抽出しました。 次に、6485×ｇ（10,000 rpm in an Anke GL-20G-Ⅱ centrifuge, Shanghai Anke company, Ltd., Shanghai, China）で25℃で15分間遠心分離した後、上澄みを収集した。 上清を、100 gのAmberlite®XAD-7HPマクロポーラスレジン（Sigma Aldrich Co.,St.Louis.MO.USA）が含まれるまで蒸発させました。 カラムを脱イオン水で洗浄した後、35％エタノール中の1％酢酸で1 mL / minの流速で溶出しました。 次に、粗抽出液を蒸発させ、凍結乾燥し、-40℃で保存しました。 |
| 2.4 模擬移動床（SMB）によるアントシアニンの精製 |
| 模擬移動床クロマトグラフィー（HYSMB6-500）は、Beijing Xiang Yue Huang Yu Technology Development Co.,Ltd.（北京、中国）から提供されました。 数学的原理モデルは、厳密な数学的第一原理モデルとマルチカラム連続クロマトグラフィープロセスの正確な動的モデルに基づいています。 アントシアニン抽出液を超音波でホモジナイズし、1％酢酸を含む25％エタノールに50 g / Lの濃度で、0.45 mの膜を通して溶解し、最初の模擬移動床フィードとして使用する原料溶液を形成しました。 この模擬移動床システム（図1）では、溶出ゾーン（ゾーンI）、精製（ゾーンII）と吸着ゾーン（ゾーンIII）、および洗浄ゾーン（ゾーンIV）を含む4ゾーンの作業モデルが設定されました。ゾーンごとに2つの列があります。 模擬移動床には、2/2/2/2として構成されたC18（30μm）フィラーを備えた8つのカラム（10mm×150mm）が装備されていました。 液体は1％酢酸を含む25％エタノールでした。 ポンプFとDは溶出のために供給と脱着剤にポンプで送られ、ポンプEとRは抽出物とラフィネートをポンプで排出しました。 QE、QR、QD、およびQFは、それぞれ抽出物、ラフィネート、脱着剤、および供給物の流量です。 模擬移動床精製アントシアニン抽出物（以下SMB CANと記載）溶液をロータリーエバポレーターで真空乾燥し、凍結乾燥して粉末にした後、-40℃で保存しました。 HPLC-PDAを使用して、模擬移動床プロセス中の抽出物とラフィネートをモニターし、純度は、278nmでの総ピーク面積に対する対応するアントシアニンピークの面積によって計算されました。 |
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| 図1。ブラックチョークベリー果実からのアントシアニンの単離と精製の概略図。 アントシアニンは超音波抽出法によって分離され、粗抽出物は模擬移動床クロマトグラフィー（SMB）のフィードとしてXAD-7HPマクロポーラス樹脂によって調製されました。 模擬移動床の分離ゾーンはゾーンIIとIIIであり、固相はゾーンIとIVで再生され、ゾーンごとに2つのカラムがありました。 液相（黒）は、入口用の供給液と脱着剤、およびポンプEとポンプRによる出口用の抽出物とラフィネートで構成されていました。 液相はポンプFによって粗抽出物を連続的に供給され、ポンプDによってエタノールで溶出された。 次に、抽出物からSMBACNを収集しました。 列は、切り替え時間間隔で反時計回り（灰色）に切り替えられました。 |
| 2.5 HPLC-PDAおよびUPLC-QTOF-MS分析 |
| アントシアニン抽出粉末を10％酢酸と1％リン酸を含む水に溶解しました。 次に、すべてのサンプルを9339×g（12,000 rpm）、4 Cで10分間遠心分離し、上清をHPLC-PDAおよびUPLC-QTOF-MS分析に使用しました。 |
| HPLCシステムは、ポンプ（LC-20 AT）とフォトダイオードアレイ（PDA）検出器（SPD-10A）（島津製作所、東京、日本）で構成されていました。 分析カラムは、Intertsil ODS-SP C18カラム（4.6 250 mm、5 m、GL Sciences Inc.,東京、日本）でした。 移動相Aは水中の10％酢酸と1％リン酸で、移動相Bは100％アセトニトリルでした。 溶出は1.0mL / minの流速で行い、溶媒勾配は次のとおりでした。 0〜8分、10％B; 8〜12分、Bは10％〜40％。 12〜15分、40％B; 15〜25分、40％〜10％B。 注入量は20Lで、カラムは25℃でサーモスタットをかけました。 分析波長は、模擬移動床プロセスのモニタリングでは278 nm、アントシアニンの定量では520nmでした[21]。 UV-VISスペクトルは220〜800nmでスキャンされました。 シアニジン3-O-ガラクトシドは、シアニジン3-O-ガラクトシド（y = 18,674x + 11,660、R2 = 0.9994）およびシアニジン3-O-グルコシド、シアニジン3-O-アラビノシドを使用して定量化されました。 シアニジン3-O-キシロシドは、シアニジン3-O-グルコシドを使用して定量化されました（y = 25,228x + 10,850、R2 = 0.9990）。 純度は、278nmでのHPLC-PDAでのこれら4つのアントシアニンの面積正規化法によって決定されました。 アントシアニン含有量は、保持時間と吸収スペクトルを比較することによって決定され、UPLC-QTOF-MSによってさらに確認されました。 |
| XevoG2QTOF質量分析計（Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード）と組み合わせたWaters ACQUITY UPLCシステムを、前述のようにアントシアニンの確認に使用しました[22]。 アントシアニンの分離は、HSS T3カラム（2.1 mm 100 mm、1.8 m）で行いました。 移動相は、（A）水+ 0.2％ギ酸および（B）アセトニトリル+ 0.2％ギ酸：0〜1分、5％B; 1〜2分、5％〜40％B; 4〜8分、95％B; 8.1〜10分、5％B。 注入量は2L、流量は0.3 mL / minでした。 ESIパラメータは次のように設定されました：負モード、キャピラリ電圧2.2 kV、サンプリングコーン電圧30 V、抽出コーン電圧4 V、ソース温度100°C、脱溶媒ガス（窒素）温度400°C、コーンガス流量20 L / h、脱溶媒ガス（窒素）流量800 L / h、衝突エネルギー6 eV、質量範囲50〜1200Da。 アントシアニンの構造は、脱プロトン化されたイオンとプロダクトイオンのフラグメンテーションパターンに従って決定されました。 |
| 2.6 DPPHフリーラジカルスカベンジングアッセイ |
| 活性酸素種(ROS)スカベンジング能力は、以前に報告されたように[23]、DPPHフリーラジカルスカベンジングアッセイによって決定されました。 アッセイは、各Cyn-3-gal（14〜449 mg / L）、アントシアニン粗抽出物（2.5〜80.0 mg / L）、およびSMB CAN（0.03）の5Lアリコートの段階希釈を使用して96ウェルプレートで実施しました。 1.0g / Lまで）。 DPPH溶液（200 L、0.06 mM）を各ウェルに添加し、プレートを暗所で室温で30分間インキュベートしました。 吸光度は、Thermo Multiskan MK3 Automated Microplate Reader（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を使用して520nmで測定しました。 EC50値は、SPSSによるTrolox（25〜250 mg / L）の検量線を使用して計算されました。 |
| 2.7 ABTSフリーラジカルスカベンジングアッセイ |
| ABTS +スカベンジングキャパシティアッセイは、いくつかの変更を加えて前述のように決定されました[24]。ABTS +溶液は、ABTS水溶液（7 mM）を過硫酸カリウム（2.45 mM）と反応させることによって生成されました。 分析には、734nmで0.700.02の吸光度を持つ希釈ABTS +溶液を使用しました。 反応は、4mLのABTS +溶液と0.4mLの各Cyn-3-gal（14〜449 mg / L）、アントシアニン粗抽出物（2.5〜40.0 g / L）、およびSMB ACN（0.03〜1.0 g / L）を添加することによって行いました。 室温で6分間インキュベートした後、734nmで分光光度計で吸光度値を測定しました。 ABTS +スカベンジング容量のEC50値は、Trolox検量線（25〜250 mg / L）を使用して計算されました。 |
| 2.8 実験動物 |
| 36匹のSprague-Dawley（SD）ラット（オス、体重250±20 g、特定病原体除去）は、Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.（北京、中国）によって購入されました。 ラットは動物施設で飼育され、22±2°C、相対湿度45±15％、12時間の明暗サイクルで標準的な餌と水を自由に摂取できました。 すべての動物は実験前に1週間適応していた。 SDラットは、コントロール（sham）、アミロイドβ（Aβ）、アミロイドβ＋精製アントシアニン（Aβ+ SMB CAN）の3つのグループ（n = 12）にランダムに分けられました。 アミロイドβおよびアミロイドβ+ SMB ACNのグループは、アミロイド1–40の脳室内注射によって治療され、次にアミロイドβ+ 精製アントシアニングループは、アントシアニン（50 mg / kgアントシアニン85％）の胃内投与によって1か月間投与されました。 実験は、動物倫理福祉委員会（No. IRM-DWLL-2017095）によって承認されました。 |
| アミロイドβ1〜40オリゴマーは、以前に報告された方法[25]に従って調製されました。 簡単に説明すると、アミロイドβ1〜40ペプチドを、滅菌ナトリウム絨毛溶液で1 mg / mLの濃度のストック溶液として調製した後、37℃で4日間インキュベートして凝集させました。 |
| ラットを10％抱水クロラール（0.3 mL / 100 g i.p.）で麻酔し、頭を定位固定装置（ZS-FD、ZS Dichuang、北京、中国）に対称的に保持しました。 頭皮はきれいに剃られ、頭蓋骨は露出していた。 PaxinosとWatsonのアトラス[26,27]に従って、ブレグマの後方-0.8 mm、外側1.4mmの座標で頭蓋骨に1つの穴を開けました。 針は、心室に4 mmの深さで、1μL/分の速度で5μL注入され、アミロイドβ1–40の注入後5分間そのままにされました。 コントロールのラットに0.9％生理食塩水を注射した。 外科的創傷を縫合し、動物をケージに戻し、餌と水を自由に摂取させ、1日間回復させた[28]。 |
| 2.9 アミロイドβ誘発損傷ラットモデルの作成 |
| アミロイドβ1〜40オリゴマーは、以前に報告された方法[25]に従って調製されました。 簡単に説明すると、アミロイドβ1〜40ペプチドを、滅菌ナトリウム絨毛溶液で1 mg / mLの濃度のストック溶液として調製した後、37℃で4日間インキュベートして凝集させました。 |
| ラットを10％抱水クロラール（0.3 mL / 100 g i.p.）で麻酔し、頭を定位固定装置（ZS-FD、ZS Dichuang、北京、中国）に対称的に保持しました。 頭皮はきれいに剃られ、頭蓋骨は露出していた。 PaxinosとWatsonのアトラス[26,27]に従って、ブレグマの後方-0.8 mm、外側1.4mmの座標で頭蓋骨に1つの穴を開けました。 針は、心室に4 mmの深さで、1μL/分の速度で5μL注入され、アミロイドβ1–40の注入後5分間そのままにされました。 コントロールのラットに0.9％生理食塩水を注射した。 外科的創傷を縫合し、動物をケージに戻し、餌と水を自由に摂取させ、1日間回復させた[28]。 |
| 2.10 モリス水迷路 |
| アントシアニンを胃内投与してから1か月後、前述のようにモリス水迷路（MWM）テストを実施しました[29]。円形のプールは直径150cm、深さ60cmで、プラットフォームは見えません（直径12cm、深さ25cm）。プールの水は黒インクと混合されました。実験中、水の温度は22〜24°C以内にとどまり、迷路の周りのすべてのランドマークは同じままでした。 モリス水迷路には、空間学習と習得の試行（隠しプラットフォームの試行）と空間プローブの試行が含まれていました。空間取得試験の前に、各ラットを水中に入れて2分間順応させ、第1象限の中央に1日間プラットフォームが表示されました。次に、水面から1cm下のプラットフォームでプールに水を追加しました。隠されたプラットフォームの試行中、各ラットは壁に面して、開始位置の1つから水中に置かれました。空間取得試行は4日間にわたって実施され、1日あたり4回の試行が行われました。動物がプラットフォームに到達した場合、タイマーは停止されました。動物が90秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合、動物はプラットフォームの位置を学習するのを助けるために15秒間プラットフォームに置かれました。空間プローブテストは5日目に行われ、その後プラットフォームが取り外されました。ラットを第3象限（元のプラットフォーム位置から180°）から解放し、ターゲット象限を横切るのに費やした時間と、プラットフォームが以前に配置されていた領域を横切った回数を90秒間にわたって記録しました。試験後、ラットをタオルで乾かして保温した。動物はビデオカメラで記録され、データは任意の迷路行動追跡ソフトウェア（Stoelting Co.,Wood Dale、IL.USA）を使用して分析されました。 |
| 2.11 ニッスル染色 |
| 脳のニッスル染色のために、ラットを0.3％抱水クロラールの腹腔内注射によって安楽死させ、100mLの生理食塩水（0.9％w / vNaCl）で経心的に灌流した。 次に、脳を取り出し、15 mLの4％パラホルムアルデヒドに入れました。 |
| クリオスタット（LeicaMicrosystems.Wetzlar.Germany）を使用して、厚さ25mの連続した冠状海馬切片を切断した。 切片を0.01M PBSで5分間2回洗浄し、1％トルイジンブルー染色液で5〜10分間室温でインキュベートしました。 次に、切片を蒸留水ですすぎ、95％エタノールに30分間浸し、100％エタノールで脱水した。 脱水後、脳をキシレンに入れ、樹脂培地を使用してカバーを滑らせた。 ニューロンは、画像ソフトウェア（Image J 1.45 s）を使用して、各グループの3匹のラットからの3つのセクションで定量化されました。 |
| 2.12 統計分析 |
| データは、少なくともGraphPad Prism 7.0ソフトウェア（GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した場合の平均SDとして3回表示されます。 p <0.05は、LSDテストによって統計的に有意であると見なされました。 結果はANOVAによって分析され、EC50値はSPSS 20.0ソフトウェア（IBM、Armonk、NY、USA）によるProbitAnalysisを使用して計算されました。 |
| 3 結果 |
| 3.1模擬移動床によるブラックチョークベリーアントシアニンの単離と精製 |
| ブラックチョークベリーからのアントシアニンを抽出し、XAD-7HPマクロポーラスレジンカラムで予備精製しました。 4セクション模擬移動床を使用して、アントシアニン粗抽出物を分離しました。 約20回のスイッチング時間の後、周期的な定常状態に達しました。 表1に示すように、流量の最適なパラメータは、QF = 0.42 mL / min、QE = 1.5 mL / min、QR = 6.5 mL / min、およびQD = 4.5 mL / minでした。 Hを実行した場合の飼料、ラフィネート、抽出物のHPLC-PDAクロマトグラムを図2A–Cに示します。 アントシアニンと不純物は、カラム3〜6で分離されます（図1）。 精製アントシアニン（SMB CAN）の純度は68％から85％と推定されました。 実行A、B、およびGでのこれらの結果は、141秒のスイッチング時間がアントシアニンを最大限に精製したことを示しています。 特定の切り替え時間で、フィード、抽出物、およびラフィネートゾーンの流量がわずかに減少すると、分析BからC、EからG、およびDからHと比較して純度が向上しました。 これらの結果により、模擬移動床のパフォーマンスは、主にフィード、抽出物、およびラフィネートの切り替え時間と流量に関連していることが確認されました[30]。 |
| 表1.SMBの操作パラメーターと分離パフォーマンス |
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| 図2 278 nmでモニターされた模擬移動床プロセス中のフィード（A）、ラフィネート（B）、および抽出物（C）の精製アントシアニン（HPLC-PDA）クロマトグラム。 |
| アントシアニン粗抽出物と精製アントシアニン（SMBCAN）を分析するために、HPLC-PDAを使用して定量し、UPLC-QTOF-MSを使用してアントシアニンを同定しました。 粗抽出物のHPLCクロマトグラムは、4つのピークを示しました（図3A）。 シアニジンのUV-VISスペクトルの最大値は516nmでした。 精製アントシアニン（SMB CAN）は、主にHPLC-PDA（図3B）によって2つのピークを示し、UPLC-QTOF-MS（図3C、D）によって識別されました。 シアニジン3-O-ガラクトシドのピーク1（m / z 449.1089 / 287.0560）が主要なピークとして現れました。 ピーク2は、それぞれの親の検出によりシアニジン3-O-アラビノシドおよびプロダクトイオンペア（m / z 419.0975 / 287.0557）として同定されました。 粗抽出物の4つの化合物は、シアニジン3-O-ガラクトシド（総アントシアニンの72.9％）、シアニジン3-O-グルコシド（2.7％）、シアニジン3-O-アラビノシド（21.0％）、およびシアニジン3-O-キシロシド（3.4％）でした（表2）。 これはOszmianskiの結果[31]と一致しています。 粗抽出物中の総アントシアニンの質量は2.290.19 g / 100 g乾燥抽出物であり、SMBACN中の総アントシアニンの質量は61.026.46 g / 100g乾燥アントシアニンに富む画分でした。 |
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| 図.3 UPLC-QTOF-MS質量スペクトルおよび構造 |
| （A）520 nmでのブラックチョークベリーアントシアニン粗抽出物のHPLC-PDAクロマトグラムおよびUV-VISスキャンスペクトルとピーク同一性（1：シアニジン3-O-ガラクトシド; 2：シアニジン3-O-グルコシド; 3：シアニジン3- O-アラビノシド; 4：シアニジン3-O-キシロシド）; （B）520nmでの精製アントシアニン（SMBACN）のHPLC-PDAクロマトグラムとピーク同一性（1：シアニジン3-O-ガラクトシド; 2：シアニジン3-O-アラビノシド）; 精製アントシアニン（SMB CAN）ピーク1およびピーク2のシアニジン3-O-ガラクトシド（C）およびシアニジン3-O-アラビノシド（D） |
| 表2 ブラックチョークベリー粗抽出物および精製アントシアニン（SMBACN）中のアントシアニンのHPLC定量およびUPLC-QTOF-MS同定 |
| データは、新鮮な果実の重量（FW）と乾燥抽出物の重量（DW）で表されます。 ND：検出されません。 |
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| 模擬移動床はアントシアニンを継続的に精製し、2つの主要なアントシアニンを効率的に濃縮し、不純物を排除しました。 同様の観察がWangによって行われ、Wangは、2段階のシミュレートされた移動床クロマトグラフィープロセスの使用を次のように報告しました。 茶ポリフェノールからEGCGを精製します[32]。 模擬移動床は、天然抽出物から二次代謝産物を分離および精製するための非常に効率的な方法であることが示唆されました。 アントシアニンなどの二次代謝産物の不安定性と植物フェノールの複雑さのために、モノマーの抽出プロセスは非常に困難でした。 したがって、これらの結果は、模擬移動床がブラックチョックベリーからアントシアニンを分離および精製するための実行可能で効果的な戦略である可能性があることを示しています。 |
| 3.2ブラックチョークベリーアントシアニン抽出物のフリーラジカル捕捉能力 |
| 模擬移動床精製プロセスを評価するために、ブラックチョークベリーアントシアニン粗抽出物とSMB精製アントシアニン抽出物のDPPHおよびABTSフリーラジカル捕捉能力をテストしました。 図4に示すように、アントシアニン粗抽出物のEC50値（訳者注：薬物や抗体などが最低値からの最大反応の50%を示す濃度のことを指す）は、トロロックス（訳者注：ビタミンEと同様に抗酸化物質） 、シアニジ3-O-ガラクトシド（Cyn-3-gal）、および精製アントシアニン（SMB CAN）のフリーラジカル捕捉能よりも有意に高かった（p <0.001）。 DPPHおよびABTS +粗抽出物の除去（54.18 19.59 g / Lおよび4.211.50 g / L）は、精製アントシアニン（SMB CAN）（0.83 0.20 g / Lおよび0.140.06 g / L）の65倍および30倍でした。 精製アントシアニン（SMB CAN）のEC50が低いことは、抗酸化活性が高いことを示しています。さらに、精製アントシアニン（SMB CAN）のABTSラジカル捕捉能力は、シアニジ3-O-ガラクトシド（Cyn-3-gal）およびトロロックスと同様でした（p> 0.05）。 これらの結果は、模擬移動床プロセスがアントシアニン抽出物のフリーラジカル捕捉能力を高めたことを示唆しています。 |
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| 図４ ブラックチョークベリ抽出アントシアニンのフリーラジカル捕捉活性 |
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（A）トロロックス、シアニジン3-O-ガラクトシド（Cyn-3-gal）、アントシアニン粗抽出物、および精製アントシアニン（SMBACN）のDPPHフリーラジカル捕捉活性。 （B）トロロックス、シアニジン3-O-ガラクトシド（Cyn-3-gal）、アントシアニン粗抽出物、および精製アントシアニン（SMBACN）のABTSフリーラジカル捕捉活性。 日付けは平均SD（n = 6）を表し、フリーラジカル捕捉のEC50阻害によって表され、一元配置分散分析のLSDテストによって*** p 0.001で表されました。 |
| 結果は、アントシアニン抽出物のABTSフリーラジカル捕捉能力がDPPHのそれよりも高いことを示しました。特に、シアニジン3-O-ガラクトシドは、そのヒドロキシル基のために高いフリーラジカル捕捉能力を持っていました。 アントシアニン抽出物は、主に水素原子移動によってDPPHフリーラジカルを中和し、高速の非選択的電子移動プロセスによってABTS +を中和した可能性があります。 したがって、模擬移動床クロマトグラフィーの適用により、アントシアニンが精製および濃縮され、粗抽出物よりも抗酸化能力が向上しました。 Deneva et alは、アントシアニンがブラックチョークベリーポリフェノールの中でプロアントシアニジンに次いで2番目に抗酸化活性に寄与することを発見しました[3]。 さらに、シアニジン-3-O-グルコシドは、Nrf2シグナル伝達経路を介してSH-SY5Y細胞のA 1–40によって誘導される細胞の抗酸化防御を調節する可能性があります[33]。 精製されたアントシアニンは、フリーラジカルを除去し、アミロイドβ1–40の神経毒性を阻害する可能性があります。 したがって、この研究の次のセクションは、ラットで誘発されたアミロイドβに対する神経保護活性を調査する精製アントシアニン（SMBACN）に関係しています。 |
| 3.3 アミロイドβ誘発毒性ラットの記憶障害に対するアントシアニンの保護 |
| モリス水迷路（MWM）は、ラットの空間学習と記憶を評価する方法です。 すべてのグループの逃避潜時は、4日間で減少傾向にありました（図5A）。 結果は、精製アントシアニン（SMB CAN）治療グループが1日目から2日目までの学習曲線がそれほど急ではないことを示しました。これは、アントシアニンが短期記憶を増加させたことを示している可能性があります。 コントロールのグループは、アミロイドβ+精製アントシアニン（ SMBACN）グループよりも安定した空間学習率を示しました。 プローブ法（訳者注：情報バイアスをコントロールするために用いられる盲検法の一つ）では、コントロールのグループの標的象限で費やされた時間は、アミロイドβ1–40によって損なわれたアミロイドβグループと比較して短く、アミロイドβグループがより低い長期学習および記憶能力を示したことを示しました（図5B）。 アントシアニン抽出物を投与されたラットは、アミロイドβ誘発グループと比較してより多くのプラットフォーム交差を達成し、コントロールグループとの有意差はありませんでした（図5C）。 |
| 結果は、アントシアニングループがアミロイドβ誘発グループよりも有意に高い空間学習能力を持っていることを示しました（p <0.05）。 興味深いことに、これは有意ではなく、ラット間の相互変動性が原因である可能性がありますが、コントロールグループはアミロイドβグループよりも高いスコアを達成しました。 図5Dに示すように、アミロイドβ+ 精製アントシアニン（SMB CAN）グループは、水泳経路に関してアミロイドβグループと比較して行動障害を軽減しました。 行動試験の結果は、精製されたアントシアニン抽出物が、空間学習と記憶に対するアミロイドβによって誘発された損傷を軽減することを示しました。 |
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| 図5 精製アントシアニン処理は、アミロイドβ誘発性の空間学習障害を軽減しました。 |
（A）コントロール、アミロイドβ、およびアミロイドβ +精製アントシアニングループの空間取得試行中の逃避潜時。 （B）空間プローブテストのターゲット象限で費やされた時間。 （C）空間プローブテストのプラットフォーム交差の数。 （D）空間取得トライアルの遊泳経路。 結果は、平均SD（n = 12）で表され、一元配置分散分析のLSDテストでは* p <0.05、** p <0.01で表されました。 |
| 以前の報告では、アントシアニンガラクトシドはグルコシドと比較して腸内でよりよく維持されているが、アラビノシドまたはキシロシドはごくわずかな損失しか示さなかった[34]。 特に、シアニジン3-O-ガラクトシドとシアニジン3-O-アラビノシドは、血液脳関門を通過して皮質と海馬に入りました[16]。 さらに、ブラックチョークベリーの神経保護能力が報告されています。 さらに、アントシアニンは老化防止に関連しています[7]。 アントシアニンは、神経細胞におけるDNA損傷シグナル伝達経路と抗酸化酵素の発現を調節することにより、細胞周期と老化を調節することが示されました[7,11]。 我々の結果は、精製アントシアニン（SMB CAN）の投与が、アミロイドβ誘発性の重度の行動機能障害による学習および記憶障害を改善するという仮説を支持します。 |
| 3.4 ラット脳における精製アントシアニン抽出物の神経保護効果 |
| アントシアニンの神経保護効果をさらに解明するために、海馬を調べました。 ニッスル染色は、すべての細胞の核、およびニューロンの核を取り巻く物質の塊を染色します。 脳、特に海馬のCA1領域[35]および前脳基底部におけるニューロンの喪失は、アルツハイマー病の最も重要な病理学的特徴の1つです[36]。 脳の海馬のCA1およびCA3領域の錐体細胞は、記憶と感情を調節します[37]。 |
| 結果は、コントロールのグループのCA1とCA3のニューロン細胞の生存率がアミロイドβ1–40治療グループよりも長かったことを示しました（p <0.05）（図6）。 アミロイドβグループのニューロンは、アミロイドβの神経毒性のために無秩序になり、深い染色核で変形しました。 コントロールのグループの結果は、脳室への注射が海馬領域に損傷を与えなかったことを示しました。 アミロイドβ+ 精製アントシアニングループの視野内のニューロンとカーネルはAβグループよりも明確で無傷であり、CA1とCA3の錐体細胞の数は大幅に増加しました（p <0.05）。 アミロイドβ1–40処理グループのニューロンは、まばらな細胞配列、細胞体の腫れ、完全性の喪失、細胞質の収縮、卵形または三角形の核など、広範な変性変化によって損傷を受けました[38,39]。 これらの結果は、アミロイドβ1–40が錐体細胞の細胞喪失と解体を誘発する可能性があることを確認し、アントシアニンの治療がこれらの変化を逆転させて記憶喪失を軽減できることを示しました。 |
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| 図6 ラット脳における精製アントシアニン抽出物の神経保護効果 |
| コントロールのグループ（A、B）、アミロイドβグループ（C、D）、およびアミロイドβ+ 精製アントシアニングループ（E、F）の海馬のCA1およびCA3領域におけるニッスル染色の代表的な画像。 （G）ラット脳の脳室内注射の部位（黒）および海馬のCA1およびCA3領域の切片の部位（H）。 数値は、CA1（I）およびCA3（J）で生き残ったニューロンを示し、* p <0.05および** p <0.01でした。 各グループの染色切片を200倍の倍率で観察した。 スケールバー=100μm。 |
| この研究は、模擬移動床によって精製されたアントシアニンが酸化ストレスに対して優れた抗酸化活性を示し、脳内のアミロイドβ誘発性神経毒性を防ぐことを示しています。 ただし、そのような処理の有効性を判断するには、invivoでの抗酸化能力のメカニズムとアントシアニンとその代謝物のバイオアベイラビリティを調査する必要があります。 細胞の抗酸化システムを調節し、アミロイドβ神経毒性を軽減するアントシアニンの細胞シグナル伝達経路は、まだ調査する必要があります。 UPLC-QTOF-MSを使用して、ブラックチョークベリーアントシアニン粗抽出物を分析し、抗酸化作用を持つポリフェノールなどの多くの二次代謝産物を発見しました。 将来の研究では、ブラックチョークベリーの神経保護能力は、酸化ストレスから神経細胞を保護するこれらの二次代謝産物化合物の能力と関連していることがわかるかもしれません。 |
| 4.結論 |
| この研究では、ブラックチョークベリー（アロニアメラノカルパ）からのアントシアニンが、XAD-7HPマクロポーラスレジンと模擬移動床クロマトグラフィーによって分離および精製され、85％の純度が得られました。 主な精製アントシアニン（シアニジン3-O-ガラクトシドおよびシアニジン3-O-アラビノシド）は、強力な抗酸化能を有し、アミロイドβ誘発性神経毒性ラットの学習および記憶障害を改善しました。 まとめると、これらの結果は、模擬移動床（SMB）クロマトグラフィーが、非常に生物活性の高いアントシアニンをブラックチョークベリーから分離するための実行可能で効果的な戦略である可能性があることを示しています。 本研究は、二次代謝産物を天然植物から分離して、それらの神経保護能力を活用する方法を確立する試みでした。 |
| 参考文献（本文中の文献No.は原論文の文献No.と一致していますので、下記の論文名をクリックして、原論文に記載されている文献を参考にしてください） |
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| この文献は、Foods 2021, 10, 63に掲載されたIsolation of Neuroprotective Anthocyanins from Black Chokeberry (Aronia melanocarpa) against Amyloid-_-Induced Cognitive Impairment. を日本語に訳したものです。タイトルをクリックして原文を読むことが出来ます。 |